蘋果IRAP體系的建立及蘋果芽變無(wú)性系的鑒定.pdf

1、蘋果(Malus domestica Borka)是世界范圍內(nèi)一種重要的果樹之一，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了豐富的遺傳多樣性。本研究以蘋果屬元帥系和富士系芽變品種為試材，建立了蘋果屬植物逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-retrotransposon amplified polymorphism，IRAP)技術(shù)體系，利用此體系構(gòu)建了元帥系和富士系芽變品種的指紋圖譜，進(jìn)行了蘋果芽變無(wú)性系的鑒定。利用ARL5引物在芽變品種‘玫瑰紅’中發(fā)現(xiàn)了

2、一條特異片段，根據(jù)對(duì)此片段分析結(jié)果，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，成功將IRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為特征性片段擴(kuò)增區(qū)域(Sequence characterized amplified region，SCAR)標(biāo)記；利用反向PCR(InversePCR,IPCR)技術(shù)克隆了其側(cè)翼的未知序列，為進(jìn)一步探明蘋果芽變機(jī)理和基因功能奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 1、利用已獲得的蘋果Tyl-copia類逆轉(zhuǎn)座子LTRs建立了蘋果IRAP技術(shù)體系，對(duì)影響IRAP-PCR擴(kuò)增

3、結(jié)果的若干因子進(jìn)行了研究。優(yōu)化的體系包含：25μL反應(yīng)體系中，10×buffer2.5μL、模板DNA50ng、Mg2+2.5mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.4μmo1·L-1、TaqDNA聚合酶1U；優(yōu)化的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min，94C1min，退火1min，72℃2min，循環(huán)35次；72℃延伸10min；退火溫度根據(jù)引物溫度設(shè)定。試驗(yàn)證明利用該體系在供試芽變品種中獲得了較為理想的擴(kuò)增結(jié)果。

4、r>　　 2、利用自己開發(fā)的IRAP引物對(duì)15個(gè)元帥無(wú)性系芽變和16個(gè)富士無(wú)性系芽變進(jìn)行了鑒定。所有引物在兩類無(wú)性系芽變中均擴(kuò)增出豐富的條帶，且表現(xiàn)出多態(tài)性。以相似系數(shù)0.76為標(biāo)準(zhǔn)，供試的15個(gè)元帥無(wú)性系變異經(jīng)SAHN聚類可聚為4類：第一類包括‘元帥’、‘居家店短紅星’、‘艷紅’、‘米勒矮生’、‘矮壯’、‘紅星’、‘紅冠’、‘矮威爾’、‘早紅星’和‘華帥一號(hào)’：第二類包括‘玫瑰紅’、‘奧勒岡矮生’和‘矮紅’；‘新紅星’和‘哈蒂.勃萊

5、特’分別獨(dú)自成類。以相似系數(shù)0.74為標(biāo)準(zhǔn)，供試的16個(gè)富士芽變無(wú)性系可聚為5類，第一類包括‘長(zhǎng)富3’、‘盛放富1’、‘長(zhǎng)富6’、‘群富1’、‘煙富1’、‘竽井Ⅱ系’、‘巖手Ⅰ系’、‘富士Ⅰ系’、‘紅王將’和‘長(zhǎng)富7’；第二類包括‘富士’和‘秋富5’：第三類包括‘秋富1’和‘秋富2’：‘長(zhǎng)野Ⅰ系’和‘齋藤Ⅱ系’分別獨(dú)自成類。本研究結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)座子在蘋果基因組內(nèi)的插入方向具有隨意性，轉(zhuǎn)座插入和逆轉(zhuǎn)座子間重組是引起蘋果無(wú)性系變異的兩個(gè)重要機(jī)

6、制，本試驗(yàn)所開發(fā)的引物是進(jìn)行蘋果無(wú)性系變異研究的有力工具，為進(jìn)一步闡明蘋果無(wú)性系變異機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　 3、利用ARL5引物從元帥短枝芽變品種‘玫瑰紅’中發(fā)現(xiàn)了一條特異片段，測(cè)定了其序列：并成功將IRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。建立的SCAR標(biāo)記體系為：反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含模板DNA50ng，10×Buffer2.5μL，Mg2+3.0mmol·L-1，dNTPs0.2mmol.L-1，引物各0.2μmol·L-1，T

7、aq DNA聚合酶1U。本試驗(yàn)成功將IRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為蘋果的分子標(biāo)記輔助育種工作奠定基礎(chǔ)。
　　 4、反向PCR技術(shù)是對(duì)已知序列DNA的兩側(cè)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究的方法。本試驗(yàn)建立了IPCR酶切體系：50μL的體系中含有2μg基因組DNA、5U限制性內(nèi)切酶HindⅢ；酶切產(chǎn)物環(huán)化自連體系：50μL體系中約0.8μg單酶切基因組DNA、5μL10×T4連接緩沖液、5UT4DNA連接酶，16℃連接過(guò)夜；IPCR反應(yīng)體