山東和陜西蘋果病毒病病原鑒定及多重RT-PCR檢測(cè)體系的建立.pdf

1、本研究于2012年4月和7月先后從山東和陜西分別采集了54份和50份蘋果葉片樣品。從文獻(xiàn)中篩選了蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)，蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，蘋果綠皺果病毒(Apple green crinklevirus，AGrCV)，蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)，蘋果莖溝病毒(Apple stem groovi

2、ng virus，ASGV)和蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus，ACLSV)等5種蘋果病毒類病原物的特異性引物，對(duì)山東和陜西部分隨機(jī)挑選的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除ApMV檢測(cè)呈陰性外，從部分樣品中均檢測(cè)到其余4種病原的特異性條帶，將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序和序列分析，明確了樣品受到ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的侵染。根據(jù)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果和測(cè)得的基因序列，結(jié)合GenB

3、ank中已報(bào)道的相關(guān)病毒的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增這4種病毒類病原物的特異性引物，經(jīng)過篩選，并經(jīng)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件的優(yōu)化，最終建立了同時(shí)擴(kuò)增ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的多重RT-PCR體系。對(duì)該檢測(cè)體系進(jìn)行了特異性和靈敏性測(cè)試，結(jié)果表明，多重RT-PCR擴(kuò)增的特異性強(qiáng)，能同時(shí)檢測(cè)出4種病毒類病原物的最低檢出限為10-2 ng級(jí)。利用該多重RT-PCR選取了100份采自山東和陜西蘋果葉片樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)情況表明，在青島、煙臺(tái)

4、、渭南和咸陽4個(gè)地區(qū)的樣品中均檢測(cè)出4種病毒類病原，其中山東地區(qū)優(yōu)勢(shì)病毒種為ASPV，青島和煙臺(tái)的檢出率分別為88.9％和84.4％，而陜西地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種為ASGV和ASPV，渭南和咸陽ASGV檢出率分別是81.0％和79.3％，ASPV檢測(cè)率也分別是81.0％和79.3％。ACLSV在4個(gè)地區(qū)樣品中的檢測(cè)率相對(duì)較低。4個(gè)地區(qū)所采集的樣品中病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，其中青島、煙臺(tái)、渭南和咸陽樣品中復(fù)合侵染率分別為66.7％，75.0％，85.

5、7％和89.7％。青島、煙臺(tái)、渭南和咸陽的最主要的復(fù)合侵染類型分別為ACLSV+ASPV+ASSVd、ASGV+ASPV、ASGV+ASPV+ASSVd和ASGV+ASPV+ASSVd。
　　為研究ACLSV病毒的變異情況，將ACLSV全長(zhǎng)序列分為6段進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到了2435 bp、1435 bp、861 bp、1605 bp、1095 bp和749 bp的基因片段，經(jīng)過測(cè)序分析，確認(rèn)基因序列正確，經(jīng)DNAStar SeqMa

6、n進(jìn)行拼接得到ACLSV基因組7557 bp全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)KJ522693）。該全基因組包含3個(gè)開放閱讀框，分別編碼RNA聚合酶、運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白，5'UTR和3UTR分別有151 nt和195 nt的非編碼區(qū)。經(jīng)全基因組構(gòu)建進(jìn)化樹分析，該ACLSV全序列與日本的蘋果分離物B6序列(GenBank no.AB326224)核苷酸相似性最高，為85.9％。
　　本文研究了ASGV外殼蛋白基因(CP)的原核表達(dá)。將ASGV CP的

7、克隆重組載體和表達(dá)載體pET-28a(+)用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ于37℃酶切反應(yīng)過夜，純化回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶4℃連接反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中繁殖，經(jīng)菌液酶切和PCR鑒定，挑選陽性克隆的菌液測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，目的片段ASGV CP正確克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)中，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。提取已構(gòu)建成功的原核表達(dá)載體pET-28a-ASGV-CP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3