柑橘黃龍病菌滾環(huán)擴(kuò)增及病毒類似病原多重RT-PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、柑橘黃龍病(CitrusHuangLongBing,HLB)的病原為韌皮部桿菌屬細(xì)菌(CandidatusLiberobacters)，由柑桔木虱(Diaphorinacitri)以及帶菌接穗傳播，對于該病害有效的防治方法是培育和推廣使用無病毒苗木和及早發(fā)現(xiàn)并鏟除病株，需要一套快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)的黃龍病檢測技術(shù)?，F(xiàn)常用的檢測方法主要是PCR檢測技術(shù)，而基于鎖式探針的柑橘黃龍病滾環(huán)擴(kuò)增體系的研究是在PCR檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢

2、測技術(shù)，該方法與PCR檢測技術(shù)相比在特異性及靈敏度等方面具有更大的優(yōu)勢。鎖式探針(padlockprobe)是一種獨(dú)特的寡聚核苷酸單長鏈。由與靶序列互補(bǔ)的序列和鏈接序列兩部分組成。與靶序列互補(bǔ)的序列在探針的兩端，鏈接序列在中間。探針的特異性由兩端的序列決定，只有在兩端的序列與靶序列完全互補(bǔ)的時候，鎖式探針即可在連接酶的作用連接成環(huán)狀，在沒有靶序列或不完全互補(bǔ)時，則鎖式探針只以線性的形式存在。由于鎖式探針的這種特殊的結(jié)構(gòu)以及其擴(kuò)增方式的多

3、樣性，使得其可用于多種檢測平臺。
　　 本文根據(jù)柑橘黃龍病菌的特異性序列，按照鎖式探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)鎖式探針，并根據(jù)鎖式探針的鏈接序列設(shè)計(jì)滾環(huán)擴(kuò)增的擴(kuò)增引物。通過優(yōu)化鏈接體系與程序、核酸外切酶消化體系與程序以及滾環(huán)擴(kuò)增體系，建立起柑橘黃龍病菌的滾環(huán)擴(kuò)增體系。以常規(guī)PCR作為對比檢測其特異性，設(shè)計(jì)的滾環(huán)擴(kuò)增體系只對柑橘黃龍病病菌進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，對柑橘上的其他病原，如柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)、柑

4、橘裂皮類病毒(Citrusexocortisviroid,CEVd)等病害均不能擴(kuò)增，特異性的檢測結(jié)果與常規(guī)PCR的檢測結(jié)果相同。與常規(guī)的PCR檢測相比，滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)具有更高的靈敏度。運(yùn)用滾環(huán)擴(kuò)增檢測體系檢測到的陽性克隆質(zhì)粒的濃度為100pg/μl-100fg/μl，檢測下限為100fg/μl。運(yùn)用常規(guī)PCR檢測體系檢測到的陽性克隆質(zhì)粒的濃度為100pg/μl-1pg/μl，檢測下限為1pg/μl。本文建立的柑橘黃龍病滾環(huán)擴(kuò)增檢測體

5、系具有良好的特異性與靈敏度，該體系的建立為我國的柑橘黃龍病的疫情動態(tài)監(jiān)測與控制提供又一新的分子檢測技術(shù)。
　　 除了柑橘黃龍病以外，柑橘衰退病、柑橘裂皮病等病害也是柑橘上的重要病害，且這幾種病害時?；旌习l(fā)生。為了達(dá)到快速，準(zhǔn)確的檢測這些病害的目的，本文在柑橘黃龍病，柑橘衰退病、柑橘裂皮病單-RT-PCR的基礎(chǔ)上，建立起了CTV,HLB二重RT-PCR檢測，并對CTV,HLB,CEVd多重RT-PCR檢測體系做了優(yōu)化。由于影響多重