葡萄莖痘病毒原位RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、上個(gè)世紀(jì)九十年代發(fā)展的原位PCR技術(shù)，結(jié)合了PCR和原位雜交的優(yōu)點(diǎn)，既可檢測(cè)出樣品中低拷貝的核酸，又可確定其細(xì)胞來源和細(xì)胞中的位置，至今已成為一項(xiàng)重要的形態(tài)學(xué)研究方法，利用原位RT-PCR檢測(cè)果樹病毒，對(duì)病毒在果樹各組織中的分布進(jìn)行定位，可為果樹病毒檢測(cè)提供一種新的途徑，有助于我們了解病毒分布和傳輸?shù)淖饔脵C(jī)制，對(duì)病毒的診斷、預(yù)防、治療等提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為果樹無毒化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，具有重要的理論價(jià)值和生產(chǎn)實(shí)踐意義。 本實(shí)

2、驗(yàn)用常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出攜帶葡萄莖痘病毒的葡萄樣本，采集此樣本和實(shí)生苗2 mm左右的莖尖組織，制成石蠟切片；用制備出的生物素標(biāo)記的cDNA探針，在切片上進(jìn)行直接原位RT-PCR和間接原位RT-PCR；通過觀測(cè)經(jīng)過顯色系統(tǒng)檢測(cè)后的組織，確定葡萄莖痘病毒在莖尖中的分布情況。 本研究的主要內(nèi)容和結(jié)論如下： 1．制備出適合植物莖尖幼嫩組織的石蠟切片，得到葡萄莖尖這種幼嫩且含水量大的植物組織最佳的脫水酒精梯度和時(shí)間：組織經(jīng)4％多

3、聚甲醛固定1h，50％、70％、80％、90％、100％乙醇脫水各1h，適用于以莖尖為材料的原位RT-PCR。 2．用常規(guī)液相RT-PCR成功獲得長度為355bp的特異性片段。對(duì)特異性片段進(jìn)行回收、連接、克隆，由上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST(AF026278)比對(duì)，特異片段的同源性可達(dá)到89％。 3．利用克隆質(zhì)粒，用PCR法制備出生物素標(biāo)記cDNA探針，探針長度為355bp，并確定合適的探針濃度應(yīng)用于原位RT-