柑橘碎葉病RT-PCR檢測(cè)及脫毒技術(shù)研究.pdf

1、柑橘碎葉病(Citrus Tatter Leaf Virus Disease，簡(jiǎn)稱CTLV)是一種重要的柑橘病害，在田間，以枳或者枳橙做砧木的柑橘受碎葉病毒侵染后表現(xiàn)明顯癥狀，以其他品種做砧木的植株上癥狀不明顯或不表現(xiàn)癥狀，因而該病在生產(chǎn)上容易隱癥帶毒傳播。目前檢測(cè)柑橘碎葉病的方法有指示植物、聚丙烯酰胺凝膠電泳和分子檢測(cè)，其中RT-PCR是一種快速檢測(cè)柑橘碎葉病的方法，國(guó)內(nèi)已有應(yīng)用，但廣西尚未有開(kāi)展這方面研究的報(bào)道。廣西是我國(guó)的柑橘主產(chǎn)

2、區(qū)，有的柑橘品種如天草受柑橘碎葉病毒為害嚴(yán)重，影響到我區(qū)柑橘生產(chǎn)。為了快速了解田間柑橘植株、引進(jìn)的柑橘品種和苗木感染碎葉病情況，急需建立一套快速準(zhǔn)確的柑橘碎葉病檢測(cè)方法。熱處理結(jié)合莖尖嫁接在國(guó)內(nèi)外已被證明為脫除柑橘碎葉病的先進(jìn)有效方法。但傳統(tǒng)的熱處理盆栽植株的方法對(duì)設(shè)備和空間要求較高，步驟較繁瑣。為了尋找一種簡(jiǎn)便有效的熱處理脫毒方法，本論文開(kāi)展了利用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理插條再進(jìn)行高溫高濕培養(yǎng)進(jìn)行脫毒的研究。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　

3、　 1、運(yùn)用改良的Bugos法進(jìn)行大量樣品高質(zhì)量RNA的快速提取。進(jìn)行了RT-PCR的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，從引物、引物濃度，dNTP濃度、退火溫度等方面對(duì)RT-PCR進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的RT-PCR能非常穩(wěn)定的檢測(cè)出陽(yáng)性對(duì)照中的CTLV，靈敏度高、特異性強(qiáng)，適合對(duì)大量田間樣品的快速檢測(cè)。
　　 2、采用RT-PCR技術(shù)對(duì)廣西部分栽培品種、越南品種、中越邊境樣品、無(wú)黃龍病苗木以及脫除黃龍病的接穗進(jìn)行碎葉病快速檢測(cè)，結(jié)果表明：6個(gè)供試的廣西柑

4、橘栽培品種中有2個(gè)帶病。14個(gè)越南品種中沒(méi)有帶病。中越邊境采集的6個(gè)樣品中有1個(gè)帶病。宮川、宮本、市文、山下紅、日南一號(hào)、山川、興津7個(gè)品種，有2株興津品種檢測(cè)出CTLV。從廣西某單位采集33個(gè)已脫除黃龍病的柑橘品種（系）接穗嫁接在網(wǎng)室的實(shí)生枳殼苗上，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)出南豐蜜桔和興津攜帶碎葉病病毒。
　　 3．試管砧木苗的培養(yǎng)過(guò)程中剝除種皮可顯著提高枳殼無(wú)菌萌發(fā)的發(fā)芽率。剝除內(nèi)、外種皮處理為最優(yōu)處理，發(fā)芽率為96.7％。

5、枳殼種子用150mg/LIBA浸泡處理后，再無(wú)菌培養(yǎng)發(fā)芽率更高，可達(dá)99.4％。
　　 4．插條用不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑浸泡扦插后，經(jīng)過(guò)光照培養(yǎng)箱高溫?zé)崽幚?0天，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及不同濃度處理的插條萌芽率為53％到90％，100mg/LIBA浸泡處理的插條萌芽率最高，達(dá)到了90％，生根率達(dá)到了57％。柑橘插條熱處理脫毒過(guò)程中，能夠大量萌芽，可以達(dá)到熱處理的目的。本試驗(yàn)認(rèn)為，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理插條再進(jìn)行高溫高濕培養(yǎng)，是一種簡(jiǎn)便、有效、實(shí)用