基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的柑橘黃龍病檢測方法研究.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus huanglongbing，HLB）是世界范圍內(nèi)最具毀滅性的柑橘病害之一，給柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，實(shí)現(xiàn)其現(xiàn)場快速檢測具有重要意義。本課題以HLB最主要的病原菌Las（Candidatus Liberibacter asiaticus）為研究對(duì)象，著眼于其在現(xiàn)場檢測中存在的問題，以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)核酸提取、核酸擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測這三個(gè)模塊的快速化、簡潔化地完成進(jìn)行研究，探索新型、簡便、快速的Las現(xiàn)場檢

2、測方法。
　　本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下:
　　(1)建立了Las實(shí)時(shí)熒光PCR(Polymerase Chain Reaction)檢測方法。設(shè)計(jì)3組Las PCR引物并篩選出擴(kuò)增效果最優(yōu)的引物對(duì)，通過退火溫度的調(diào)節(jié)解決PCR的非特異性擴(kuò)增問題，最后評(píng)估了該體系的檢測靈敏度，其靈敏度與目前較常用的OI1/OI2c PCR方法相當(dāng)。綜上，所建立的Las實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法可代替OI1/OI2e PCR，用于Las的日常

3、檢測。
　　(2)建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)的Las現(xiàn)場可視化檢測方法。設(shè)計(jì)LAMP引物并優(yōu)化LAMP體系，使得LAMP在35 min內(nèi)完成。探究出氫氧化鈉(Sodium hydroxide，NaOH)粗提取柑橘葉片核酸的最優(yōu)條件為3 min裂解和50倍稀釋。隨后開發(fā)了一種新型的基于低濃度熒光染料的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可視化檢測法，并設(shè)計(jì)了一個(gè)迷你

4、熒光檢測裝置與之相配套。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可視化檢測時(shí)的背景信號(hào)來源為易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的高濃度高長度LAMP引物，但可以通過加熱去除。所建立的基于LAMP的Las現(xiàn)場可視化檢測方法的靈敏度比TaqMan PCR高100倍，其可行性也通過實(shí)際樣本的檢測得到驗(yàn)證。綜上，所建立的基于LAMP的Las現(xiàn)場可視化檢測方法簡單、快速、靈敏、可視化信號(hào)明顯、無需復(fù)雜儀器設(shè)備，適用于Las的現(xiàn)場檢測。
　　(3)建立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombin

5、ase Polymerase Amplification，RPA)的Las現(xiàn)場快速可視化檢測方法。設(shè)計(jì)了3組Las RPA引物并篩選出最優(yōu)引物對(duì)，優(yōu)化擴(kuò)增溫度為37℃。探究出NaOH核酸粗提法用于RPA檢測Las的最佳處理時(shí)間為1 min。隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SYBR GreenⅠ可視化檢測RPA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，采用0.36μM引物的RPA體系擴(kuò)增10 min后加入1μL SYBR GreenⅠ并稀釋2倍時(shí)，消除背景信號(hào)的效果最優(yōu)。同時(shí)，引入一個(gè)