蘋果銹果類病毒檢測(cè)體系的建立及傳播途徑探究.pdf

1、蘋果銹果類病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)是危害蘋果較為嚴(yán)重的非潛隱性病毒之一，也是我國(guó)蘋果的重要檢疫性有害生物。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于ASSVd檢測(cè)方面研究較少，技術(shù)還不成熟，而且ASSVd傳播方式知之甚少，尚無(wú)有效的防治措施。因此，我們建立了ASSVd準(zhǔn)確、靈敏、快速的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)體系，同時(shí)，以攜帶ASSVd組培苗和無(wú)毒組培苗為試材，通過(guò)人工模擬田間不同傳播途徑，初步明確了在組培條件下ASSVd傳播

2、方式。本研究結(jié)果將為ASSVd的準(zhǔn)確診斷提供可靠的方法，為果樹苗木檢疫、無(wú)毒苗木生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。為阻止田間生產(chǎn)過(guò)程中ASSVd的侵入與傳播提供理論依據(jù)，為有效預(yù)防蘋果銹果病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、揭示了ASSVd河北保定分離物的基因組序列及其分類地位。以采自河北保定的ASSVd樣本為試材，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)樣本中的ASSVd全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用生物學(xué)軟件MEGA6.0對(duì)該分離物與已發(fā)表的其

3、它分離物序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，ASSVd保定分離物ASSVd BD-1基因組全長(zhǎng)332nts，將序列提交到GenBank，登錄號(hào)為KR264032。該分離物與已發(fā)表的其它13個(gè)來(lái)自不同寄主、不同國(guó)家的ASSVd分離物間進(jìn)化關(guān)系極近，核苷酸相似性為92％～99％之間。與加拿大蘋果上的分離物DAVd(GenBank登錄號(hào):X71599)親緣關(guān)系最近，相似性為99％，僅在第221位有一個(gè)堿基差異，與新疆梨上的分

4、離物ASSVd-Z7（GenBank登錄號(hào):JX861259）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明:不同地區(qū)的ASSVd分離物聚類沒有規(guī)律性，ASSVd不存在地區(qū)?；浴Ｐ陆?、桃、杏、蘋果不在同一分支，說(shuō)明ASSVd可能存在一定的寄主特異性。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該分離物的中央保守區(qū)、末端保守區(qū)與ASSVd其它分離物相同。
　　2、建立了ASSVd常規(guī)RT-PCR及利用內(nèi)標(biāo)nad5基因?yàn)榛A(chǔ)的RT-PCR檢測(cè)體系。根據(jù)GenBank中已發(fā)

5、表ASSVd基因組序列，選擇保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物。以感染ASSVd田間蘋果樣本為試材，對(duì)已報(bào)道引物及自行設(shè)計(jì)引物進(jìn)行篩選，對(duì)常規(guī)和以內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的RT-PCR檢測(cè)體系和程序進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，自行設(shè)計(jì)引物ASSVdQxin3特異性最好，優(yōu)化的常規(guī)PCR體系(25μL)中cDNA模板0.5μL、ASSVdQxin3-F/R引物(20pmol/μL)各1.0μL、ddH2O10μL、2×Es Taq MasterMix12.5μL;擴(kuò)增程序中退

6、火溫度為64.4℃，循環(huán)次數(shù)為35，靈敏度達(dá)到能夠檢測(cè)3.75 ng新鮮樣本中的病毒。優(yōu)化的以內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的PCR體系(25μL)中cDNA模板2μL、ASSVdQxin3-F/R引物(20pmol/μL)各1.0μL、nad5-F/R引物(20pmol/μL)各0.1μL、ddH2O8.3μL、2×Es Taq MasterMix12.5μL;擴(kuò)增程序中退火溫度為60.9℃，循環(huán)次數(shù)為35，靈敏度達(dá)到能夠檢測(cè)37.5ng新鮮樣本中的病毒

7、。
　　3、明確了蘋果果實(shí)著色期最佳檢測(cè)部位為幼嫩韌皮部，內(nèi)標(biāo)nad5基因?yàn)榛A(chǔ)的ASSVd RT-PCR檢測(cè)體系田間應(yīng)用可靠性更高。利用優(yōu)化的檢測(cè)體系對(duì)蘋果果實(shí)著色期不同部位進(jìn)行檢測(cè)，并驗(yàn)證了兩種檢測(cè)體系的田間應(yīng)用可靠性。結(jié)果表明，果實(shí)著色期，染病植株的幼嫩葉片、一年生枝條韌皮部和木質(zhì)部、果實(shí)及部分種子樣本均能檢測(cè)到病毒，最佳檢測(cè)部位為幼嫩韌皮部，其在RT-PCR檢測(cè)中條帶亮度最高，特異性最好，且病毒檢出率為100％，而種子作為

8、檢測(cè)材料，檢出率為70％。利用內(nèi)標(biāo)nad5基因?yàn)榛A(chǔ)的ASSVd RT-PCR檢測(cè)體系和常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)保定市順平縣124株樣品進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)檢測(cè)體系病毒檢出率為22.6％，以內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的檢測(cè)體系避免了假陰性現(xiàn)象，病毒檢出率為24.2％。
　　4、明確了蘋果銹果病田間發(fā)病呈逐年加重趨勢(shì)，銹果病樹田間分布有明顯的發(fā)病中心。2012～20154年間對(duì)4個(gè)蘋果園銹果病田間顯癥情況進(jìn)行了調(diào)查，2014年對(duì)其中3個(gè)果園進(jìn)行了RT-

9、PCR檢測(cè)分析。結(jié)果表明:果園12012-2015年發(fā)病率分別為3.0％、6.0％、7.0％和10.0％;果園22012-2015年發(fā)病率分別為19.4％、24.7％、29.0％和34.4％;果園32014-2015年發(fā)病率分別為16.0％和22.0％;果園42014-2015年發(fā)病率分別為9.1％和12.1％，發(fā)病率均逐年增加。2014年通過(guò)對(duì)3個(gè)果園進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，銹果病樹田間分布有明顯的發(fā)病中心，尤其2012年顯癥果

10、樹的周圍發(fā)病中心明顯。說(shuō)明銹果病傳播及顯癥需要一定的時(shí)間，顯癥受植株個(gè)體差異和外界氣候等因素影響較大，推測(cè)可能通過(guò)根接傳播。
　　5、明確了組培條件下ASSVd的傳播途徑。以攜帶ASSVd的組培苗和無(wú)毒組培苗為試材，通過(guò)模擬田間不同傳播方式，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，最終明確ASSVd可通過(guò)汁液沾染、根部吸收（根系緊密接觸、含病毒培養(yǎng)基質(zhì)）、組培工具交叉使用進(jìn)行傳毒，其中根系傳毒是風(fēng)險(xiǎn)最高的傳播途徑;組培剪用75％酒精消毒后仍存在