烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒和類(lèi)病毒的分子鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、烏魯木齊地區(qū)是新疆馬鈴薯種薯、商品薯的重要生產(chǎn)基地。當(dāng)前馬鈴薯生產(chǎn)中病毒病發(fā)生普遍而嚴(yán)重，成為制約生產(chǎn)的主要障礙。優(yōu)質(zhì)脫毒種薯是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康、高效發(fā)展的重要保障，而建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)是脫毒種薯生產(chǎn)的關(guān)鍵。本研究調(diào)查鑒定烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯病毒種類(lèi)，研究建立重要病原病毒和類(lèi)病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，為馬鈴薯無(wú)病毒原種材料的篩選和培育，種薯調(diào)運(yùn)的檢疫檢驗(yàn)，實(shí)施病毒病害有效的防治措施提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)保障。
　　

2、 通過(guò)癥狀調(diào)查、電鏡觀察、RT-PCR擴(kuò)增及其克隆、序列分析，鑒定明確了侵染烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV，類(lèi)病毒為PSTVd。其中PVY、PLRV的侵染率最高，其次為PVX、PVA，PSTVd的侵染率較低。同源性分析表明，PVY分離物中5個(gè)為PVYO株系，1個(gè)為PVYN株系；PSTVd烏魯木齊分離物同美國(guó)Wisconsin弱系的同源性為98.4%，同法國(guó)X76844中間株系M（mild）的同源性98

3、.8%。烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯主要病原病毒分離物核苷酸序列之間絕大多數(shù)高度同源，而與有些國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)分離物則存在較大差異。
　　 針對(duì)烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒PVX、PVY、PVA、PLRV，設(shè)計(jì)病毒外殼蛋白基因特異性引物對(duì)，建立了能夠同步檢測(cè)4種病毒一步法多重RT-PCR檢測(cè)方法。該法對(duì)PVX、PVY、PVA、PLRV擴(kuò)增出的靶帶大小分別為732bp、422bp、132bp和336bp。病毒RNA最低檢測(cè)限度為7.8pg

4、/μL。對(duì)PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的擴(kuò)增為陰性。研究結(jié)果表明，該方法比兩步法多重RT-PCR檢測(cè)更加快速、簡(jiǎn)便、高效。
　　 本研究根據(jù)PVA和PVY分離物CP基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物和兩條用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針。對(duì)反應(yīng)條件和試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠同步檢測(cè)PVA和PVY的二重?zé)晒舛縋CR方法。檢測(cè)敏感度達(dá)到0.51fg/mL，比常規(guī)RT-PCR高100倍以上。