黃瓜綠斑駁花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒及南方菜豆花葉病毒的分子檢測技術研究.pdf

1、以遼寧蓋州地區(qū)表現(xiàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-LN)癥狀的西瓜葉片為材料，以總RNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得了CGMMV-LN的四段部分重疊并覆蓋全長的片段。序列分析結果表明：CGMMV-LN全長基因由6422個堿基組成，cp基因由486個堿基組成，編碼161個氨基酸，與已報道的其他11個CGMMV分離物相同。核苷酸序列同源性在90％以上，氨基酸序列同源性高于98％。CGMMV-LN的3'NTR由176個堿基組成，與CGMM

2、V-KW、CGMMV-SH和CGMMV-KOM的堿基數(shù)目相同，但比CGMMV-W多1個堿基。與其他3種Tobamovirus屬病毒3'NTR末端的17個堿基則完全一致，3'NTR序列的高度保守性有助于基因組末端RT-PCR引物的設計。 以引自加拿大的ToRSV懸鉤子分離物(TORSV_Ra)接種番杏發(fā)病后為試材，以總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴增病毒復制酶基因(RdRp)的cDNA片斷并將其克隆到pMD18-T載體上。序

3、列測定結果表明：Rasp-2 RdRp基因由2133個核苷酸組成，編碼711個氨基酸；Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之間的蛋白酶切割位點為Q/v。Rasp-2與其他分離物及株系RdRp的核苷酸序列同源性為79％．84％，氨基酸序列同源性為89％-94％。聚類分析結果顯示，葡萄黃脈株系(GYV)與其他分離物及株系關系最遠，Rasp-2與其他分離物及株系親緣關系較近。證實Rasp-2與另外2個懸鉤子分離物Rasp和Rasp-1的核苷酸

4、序列存在明顯變異。 以來自甘肅感染CGMMV的南瓜果實為試材，以總RNA為模板，根據(jù)CP設計引物，進行RT-PCR擴增。結果表明：本試驗所建立的RT-PCR檢測方法可擴增出目標片段，將其CP序列與來自國內(nèi)不同地區(qū)的其他CGMMV分離物進行序列比對，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)各分離物間的同源性為97％-99％，證明有很近的親緣關系。 采用RT-PCR方法克隆了CGMMV-LN的CP基因并連接到原核表達載體pGEX-4T-3和pET-22b(

5、+)上，將獲得的重組子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b(+)-CGMMV CP轉化大腸桿菌BL21后用IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE和Western blot分析表明，CP基因在大腸桿菌中獲得了高效表達，融合蛋白分子量分別為43.8 kDa和17.3 kDa。將17.3 kDa融合蛋白純化后免疫家兔，制備了CGMMV特異性抗血清，抗原包被間接ELISA法(ACP-ELISA)測定抗血清的效價為1/20,000

6、。 分別將CGMMV-LN和SBMV-J(日本分離物)的CP基因連接至病毒載體p45p46上，得到了相應的重組載體pPVXCGMMV-CP和pPVXSBMV-CP。以線性化的空載體以及重組載體為模板進行體外轉錄，并將體外轉錄物接種至本生煙葉片。與空載體p45p46接種的植株對比，pPVXCGMMV-CP和HpPVXSBMV-CP均表現(xiàn)為加重的系統(tǒng)花葉癥狀。通過RT-PCR擴增檢測到了CGMMV-CP和SBMV-CP基因。將CGM

7、MV-LN的CP基因和3’NTR連接至載體pGEM-3Zf上，得到相應的重組載體pGEMCGMMV-CP-3’NTR。以線性化的重組載體為模板進行體外轉錄，并以體外轉錄的RNA和總RNA為模板，建立了CGMMV的實時熒光RT-PCR檢測方法?？俁NA的檢測低限是0.13 Pg；體外轉錄RNA的檢測低限是0.03 pg，相當于13764 copies/μL。 以南方菜豆花葉病毒日本分離物(SBMV-J)總RNA為模板，采用RT-P