西尼羅病毒核酸及抗體檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià).pdf

1、西尼羅病毒(WestNilevirus，WNV)是黃病毒科黃病毒屬成員，最早于1937年于烏干達(dá)一位發(fā)熱婦女的血液中分離到。西尼羅病毒引起的西尼羅腦炎和西尼羅熱是嚴(yán)重影響人類(lèi)及動(dòng)物健康的傳染病。WNV以往僅在非洲、西亞、中東地區(qū)流行，60年代初傳入歐洲，自1999年起在西半球登陸，并相繼在美國(guó)傳播。美國(guó)CDC報(bào)道了美國(guó)2007年前半年WNV感染的情況，共有19個(gè)州的122人感染了WNV。WNV也可通過(guò)輸血及器官移植傳播。WNV的流行對(duì)人

2、類(lèi)及動(dòng)物健康產(chǎn)生巨大的威脅。 目前尚無(wú)針對(duì)WNV的特效治療藥物，亦無(wú)有效的疫苗預(yù)防WNV感染。我國(guó)目前還未見(jiàn)人感染W(wǎng)NV的病例和在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)WNV的報(bào)道。由于野生鳥(niǎo)類(lèi)是其自然宿主，攜帶病毒的候鳥(niǎo)可能導(dǎo)致病毒在不同地區(qū)之間的傳播，隨著候鳥(niǎo)的遷徙及我國(guó)與世界其他國(guó)家之間的貿(mào)易、旅游、人員往來(lái)日益頻繁，WNV通過(guò)各種途徑傳入我國(guó)的可能性很大。為有效應(yīng)對(duì)我國(guó)可能發(fā)生的WNV的暴發(fā)流行，有必要開(kāi)展對(duì)WNV檢測(cè)方法的研究。 本研究

3、首先通過(guò)選取WNV較保守的衣殼蛋白基因區(qū)作為目的擴(kuò)增片段，建立WNV熒光定量檢測(cè)體系，同時(shí)對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)。對(duì)西尼羅病毒囊膜蛋白基因進(jìn)行分析確定其抗原決定簇區(qū)域并克隆該囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域III基因，進(jìn)而通過(guò)基因重組技術(shù)獲得病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域III抗原?；诒磉_(dá)的結(jié)構(gòu)域III抗原建立WNV抗體檢測(cè)體系并對(duì)建立的檢測(cè)體系進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)評(píng)價(jià)。WNV核酸及抗體檢測(cè)體系的建立對(duì)于我國(guó)人與動(dòng)物的WNV感染監(jiān)控、人類(lèi)輸血安全以及技術(shù)儲(chǔ)備等均

4、具有重要的意義。主要分以下三個(gè)方面進(jìn)行介紹。 1.WNV核酸檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià)本研究建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)西尼羅病毒的方法。通過(guò)序列比對(duì)和blast分析，確定WNV衣殼蛋白保守區(qū)基因?yàn)闄z測(cè)的目的基因，引物采用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。本研究建立的檢測(cè)方法利用SYBRGreenI染料，相比探針?lè)ǔ杀据^低。通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析表明，建立的檢測(cè)方法在擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有二聚體的產(chǎn)生。本檢測(cè)體系在用空白對(duì)

5、照及類(lèi)似的乙腦病毒作為擴(kuò)增對(duì)照時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非特異性產(chǎn)物的生成，表明該體系對(duì)于WNV的檢測(cè)是特異的。將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，可檢測(cè)到102copies/μL樣品，表明該檢測(cè)體系具有很高的檢測(cè)靈敏度。通過(guò)6次批間重復(fù)檢測(cè)，體系的變異系數(shù)小于3％，表明該檢測(cè)體系具有良好的可重復(fù)性。 同時(shí)也對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行了重復(fù)性、特異性及檢測(cè)靈敏度的評(píng)價(jià)?？傊⒌臋z測(cè)體系可以用于我國(guó)疑似WNV感染的人群、動(dòng)物來(lái)源樣品的檢測(cè)，同時(shí)也可用于

6、血液、血液制品等中可能帶毒的樣品的系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。 2.西尼羅病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域III在昆蟲(chóng)S2細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定西尼羅病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域III(DomainIII)位于WNV病毒膜蛋白的最表面，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要保護(hù)性抗原，同時(shí)DomainIII也是WNV感染細(xì)胞時(shí)與細(xì)胞表面結(jié)合的主要位點(diǎn)。本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的WNV囊膜蛋白DomainIII基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物并分別引入NotI和NcoI酶切位點(diǎn)，用PCR方法擴(kuò)增

7、DomainIII基因片段?；厥漳康幕蚱危⒂肗otI和NcoI限制性?xún)?nèi)切酶消化，經(jīng)純化后，將其定向克隆入果蠅表達(dá)載體pMT/B/V5中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMT-DIII。測(cè)序驗(yàn)證正確后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與輔助質(zhì)粒pCoBlast共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，通過(guò)Blasticidin(殺稻瘟素)進(jìn)行加壓篩選，獲得了抗性細(xì)胞S2-DIII。提取S2-DIII細(xì)胞的基因組DNA，PCR法檢測(cè)目的基因在果蠅S2細(xì)胞中的整合與表達(dá)。用終濃度500μm

8、ol/L的硫酸銅溶液誘導(dǎo)表達(dá)，收集無(wú)血清的細(xì)胞表達(dá)上清，樣品濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE及WesternBlotting檢測(cè)。結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pMT-DIII，轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)12μg/mL的Blasticidin篩選及鑒定后獲得了穩(wěn)定表達(dá)WNVEDomainIII蛋白的果蠅S2細(xì)胞株。篩選的昆蟲(chóng)細(xì)胞重組表達(dá)DomainIII蛋白，經(jīng)初步鑒定與預(yù)期相符，為建立WNV抗體ELISA檢測(cè)體系提供了標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照抗原。 3.W

9、NV抗體檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià)利用重組的西尼羅病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域III蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原建立其抗體檢測(cè)體系。通過(guò)優(yōu)化條件確立抗原的最佳包被濃度為2.5ug/mL，對(duì)照用抗體使用濃度為1600倍稀釋。對(duì)建立的體系進(jìn)行評(píng)價(jià)表明，該檢測(cè)體系對(duì)WNV的檢測(cè)特異性較高，且對(duì)其它類(lèi)似病毒如乙腦病毒、牛病毒性腹瀉病毒等的檢測(cè)交叉反應(yīng)性低。批內(nèi)檢測(cè)時(shí)平均值為1.002，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0423，變異系數(shù)為0.0422。批間檢測(cè)時(shí)平均值為1.162，標(biāo)準(zhǔn)差為0.