人細(xì)小病毒B19抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、人細(xì)小病毒B19(human parvovirus B19)為細(xì)小病毒科紅病毒屬的成員，主要通過(guò)呼吸道傳播，也可通過(guò)輸血或血液制品傳播，還可以在母嬰之間垂直傳播。對(duì)于免疫功能正常的人群，B19主要引起兒童的傳染性紅斑和成年人的關(guān)節(jié)痛或關(guān)節(jié)??；而對(duì)于免疫力低下者，感染 B19會(huì)引起單純紅細(xì)胞再生障礙及慢性貧血；對(duì)于孕婦，B19感染嚴(yán)重時(shí)可致胎兒水腫，宮內(nèi)死胎等。
　　由于目前國(guó)內(nèi)沒有商業(yè)化的B19抗體檢測(cè)試劑，有必要建立B19血清抗

2、體檢測(cè)方法。
　　本研究擬利用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)B19病毒衣殼蛋白VP2，用純化后的VP2蛋白作為檢測(cè)抗原，初步建立抗B19血清IgG和IgM抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法。
　　一、人細(xì)小病毒B19衣殼蛋白VP2的制備
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?利用原核表達(dá)系統(tǒng)和重組腺病毒真核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)并純化B19病毒衣殼蛋白VP2.方法:分析VP2編碼區(qū)，利用重疊延伸PCR合成密碼子優(yōu)化的VP2基因，測(cè)序驗(yàn)證后，

3、亞克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)或pET44a(+)，分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)的宿主菌，利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。包涵體蛋白在變性后使用DEAE瓊脂糖陰離子交換層析法或固化金屬層析法純化；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析評(píng)價(jià)純化效果；將部分純化蛋白免疫新西蘭大白兔，收集抗血清，再利用親和層析法分離純化血清IgG。在構(gòu)建腺病毒表達(dá)系統(tǒng)過(guò)程中，先構(gòu)建攜帶B19 VP2基因的穿

4、梭質(zhì)粒，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在E。coli BJ5183菌株中同源重組產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒，線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，拯救并擴(kuò)增攜帶 VP2基因的重組腺病毒 Ad5-VP2；Ad5-VP2感染293細(xì)胞，Western blot檢測(cè)B19 VP2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:重疊延伸PCR結(jié)合突變校正方法，最終得到密碼子優(yōu)化的B19 VP2編碼區(qū)；成功構(gòu)建了兩種原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的以包涵體形式高效表達(dá)；采用更換表達(dá)載體和表達(dá)細(xì)胞等多種

5、實(shí)驗(yàn)方案，未能實(shí)現(xiàn) VP2蛋白的可溶性表達(dá)；采用變性條件下的陰離子交換層析由包涵體得到純化的VP2蛋白，多步透析、降低變性劑濃度復(fù)性得到部分可溶性蛋白。變性的純化蛋白免疫動(dòng)物，得到抗 B19 VP2的兔 IgG，并進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。另外，成功構(gòu)建了攜帶 B19 VP2基因的重組腺病毒，在其感染的293細(xì)胞能夠檢測(cè)到B19 VP2的表達(dá)，但其表達(dá)量低，不足以形成病毒樣顆粒(VLP)或用于蛋白純化。結(jié)論:采用多種實(shí)驗(yàn)方案成功表達(dá)了VP

6、2，但未能獲得B19 VP2形成的VLP；通過(guò)包涵體變性-復(fù)性最終獲得了可溶性VP2，并制備了HRP標(biāo)記的兔抗B19 VP2 IgG，為建立檢測(cè)人血清抗B19抗體的ELISA方法打下了基礎(chǔ)。
　　二、人細(xì)小病毒B19抗體檢測(cè)方法的建立
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?建立人血清細(xì)小病毒B19抗體(IgG和IgM)檢測(cè)的ELISA方法。方法:先以不同濃度人IgG包被ELISA板，確定辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體的適宜稀釋度；再以棋盤

7、滴定的方法確定可溶性VP2使用濃度、人血清稀釋度以及包被液的種類，建立檢測(cè)人血清B19 IgG的間接ELISA方法。以可溶性VP2包被ELISA板，確定HRP標(biāo)記兔抗VP2 IgG的使用稀釋度；再以棋盤滴定的方法確定抗人IgM抗體的包被濃度和血清稀釋度，建立捕獲ELISA方法檢測(cè)人血清抗B19 IgM抗體。最后利用建立的ELISA方法對(duì)355份孕婦和獻(xiàn)血員的血清進(jìn)行了檢測(cè)，并以德國(guó)維潤(rùn)公司的人細(xì)小病毒B19 IgG/IgM定量檢測(cè)試劑盒

8、為對(duì)照，分析檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果:在人血清細(xì)小病毒B19 IgG抗體檢測(cè)的ELISA建立中，確定了包被抗原VP2的濃度為5μg/ml，封閉液的成分為5％NCS的PBS，封閉時(shí)間為2h，山羊抗人IgG-HRP的稀釋比例為1:10000；在人血清細(xì)小病毒B19 IgM抗體檢測(cè)的ELISA建立中，確定了兔抗人IgM的包被濃度為5μg/ml，封閉液的成分為5％的NCS，抗原 VP2的稀釋比例為1:100，兔抗人VP2-HRP的稀釋比例為1:6000.