牛細(xì)小病毒檢測(cè)試劑的制備及快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、牛細(xì)小病毒感染(Bovine parvovirus infection)是由牛細(xì)小病毒(Bovine parvovirus，BPV)引起牛的一種主要以母牛生殖機(jī)能障礙和犢牛消化道、呼吸道癥狀為特征的傳染性疾病。1961年Abinanti和Warfield首次從健康犢牛糞便中分離出細(xì)小病毒。因其具有血細(xì)胞吸附性能，故又稱血細(xì)胞吸附腸病毒(Hemadsorbing enteric，HADEN)。其后從暴發(fā)BPV感染的牛群中進(jìn)行病毒的分離鑒定

2、和血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明在一些牛群中BPV感染發(fā)病率較高，亦有血清學(xué)調(diào)查報(bào)道目前該病屬全球范圍流行。目前，我國(guó)對(duì)牛細(xì)小病毒及其感染研究較少，我國(guó)牛群是否存在細(xì)小病毒感染，其感染和危害的程度如何，尚缺乏較為清晰的背景資料。實(shí)踐中缺乏檢測(cè)BPV感染的抗原與抗體試劑也制約了我國(guó)對(duì)該病的檢測(cè)。因此研究開發(fā)出檢測(cè)BPV感染特異性強(qiáng)、敏感性高的病原和血清檢測(cè)試劑顯得尤為重要。
　　 首先，本研究根據(jù)GenBanK上公布的BPV基因組序列，選取

3、VP2基因高度保守區(qū)域作為靶基因，通過(guò)生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)篩選出1套LAMP引物。以BPV原代細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA為模板，建立BPV-LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間、鎂離子濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，LAMP最佳反應(yīng)溫度是63℃，反應(yīng)時(shí)間為60min，鎂離子濃度為8mM/L，甜菜堿濃度為1.2mM/L，F(xiàn)IP和BIP的濃度分別為1.6μM/L，F(xiàn)3和B3的濃度分別為0.2μM/L，內(nèi)外游引物濃度比為8:1。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后初步建立的BPV-

4、LAMP方法，最低可檢測(cè)到9個(gè)拷貝的BPV DNA，是普通PCR方法敏感性的100倍。與可能存在交叉反應(yīng)的病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn)，只有BPV擴(kuò)增出特異性條帶，而其他病毒(BRV、BVDV、BHV、GPV、PPV)均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)。表明建立的BPV-LAMP方法具有良好的敏感性和特異性。此方法可根據(jù)反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物是否變渾濁判定結(jié)果，或加入SYBR GreenⅠ染料，在自然光或紫外光下判定結(jié)果。采用LAMP和PCR同時(shí)檢測(cè)59份糞便樣本，

5、兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為94.9％。結(jié)果表明，建立的BPV-LAMP具有快速、敏感、特異、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床BPV感染的檢測(cè)。
　　 本研究根據(jù)GenBanK上公布的BPV VP2基因設(shè)計(jì)引物，以BPV-VR767株的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增出2019 bp的VP2基因，利用生物學(xué)軟件對(duì)VP2基因序列進(jìn)行抗原性預(yù)測(cè)分析，選擇抗原性優(yōu)勢(shì)區(qū)域，將VP2基因分為三段(34～263aa，300～451aa和484～633a

6、a)，分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上，獲得了重組質(zhì)粒pET-28a-VP2-1、pET-28a-VP2-2和pET-28a-VP2-3，將其分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21或Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別得到大小為30.2ku、22.7ku和22.9 ku的目的蛋白。經(jīng)Western-blot和間接ELISA分別檢測(cè)三個(gè)重組蛋白的反應(yīng)原性；用純化的三個(gè)重組蛋白分別免疫昆明鼠，利用間接ELISA檢測(cè)抗體產(chǎn)生的效價(jià)和特異性識(shí)別

7、重組抗原的能力，評(píng)價(jià)其免疫原性。結(jié)果顯示，Western-blot和間接ELISA證實(shí)BPV陽(yáng)性血清均能夠識(shí)別三個(gè)重組蛋白，表明表達(dá)的三個(gè)重組蛋白均具有抗原性；免疫小鼠中均產(chǎn)生特異性抗體，血清效價(jià)最高可達(dá)1.28×105，制備的三種重組蛋白抗血清均可與BPV全病毒抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明制備的抗血清均可識(shí)別BPV抗原，三個(gè)重組蛋白均具有良好的免疫原性。其中VP2-3(484～633aa)基因片段所表達(dá)的重組蛋白抗原性最好，表明分段表達(dá)并

8、純化的VP2蛋白具有病毒天然蛋白抗原反應(yīng)活性。
　　 利用純化后的重組VP2-3蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)BPV抗體的間接ELISA方法。通過(guò)試驗(yàn)確定了最佳反應(yīng)條件，抗原的最適包被濃度為20μ g/mL、血清最佳稀釋倍數(shù)為1:40、血清最適作用時(shí)間為1h、最適封閉液為2.5%脫脂乳、酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:5000、酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間為1h、OPD-H2O2最佳顯色時(shí)間為10min。判定標(biāo)準(zhǔn)為OD490nm≥0.185者判

9、為抗體陽(yáng)性，否則判為抗體陰性。包被的重組抗原不與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛皰疹病毒(BHV)、牛副流感病毒3型(BPI3)和牛布魯氏菌病(B.abortus)的陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。該方法與血凝抑制試驗(yàn)相比較，符合率為91.38%。用該方法對(duì)黑龍江省部分地區(qū)采集到的678份牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有353份血清