人細(xì)小病毒B19 VP1表達(dá)蛋白的純化及免疫活性的研究.pdf

1、人細(xì)小病毒B19(human parvovirus b19, PVB19)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中目前已知的唯一致人類(lèi)疾病的病毒，也是動(dòng)物病毒中體積最小結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的DNA 病毒?，F(xiàn)已證實(shí)該病毒與多種兒童及成人疾病有關(guān)。1990 年我科首次證實(shí)國(guó)內(nèi)存在該病毒感染，隨后的研究發(fā)現(xiàn)其是我國(guó)兒童急性再生障礙性貧血、急性血小板減少性紫癜、胎兒水腫及孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病的重要病因之一，并與先天性心臟病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病相關(guān)。 B1

2、9 病毒是由5.6Kb 核苷酸組成，編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)和兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1, VP2)。B19 病毒殼蛋白主要由VP2 蛋白組成，VP1 蛋白不超過(guò)殼蛋白的10％，其獨(dú)特區(qū)暴露在病毒的表面。B19 病毒的抗原表位區(qū)集中在VP1獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2 連接區(qū)。只有VP1 獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2 連接區(qū)基因編碼的蛋白才能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。非結(jié)構(gòu)蛋白NS和B19病毒毒力有關(guān)。VP1和VP2 蛋白，特別是VP1 獨(dú)特區(qū)，對(duì)B1

3、9 病毒的診斷和保護(hù)性疫苗的制備非常有意義。 但是，由于B19 病毒不能在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，使B19 病毒抗原來(lái)源十分困難；加之XA 株B19 病毒VP1 獨(dú)特區(qū)在核苷酸水平和氨基酸水平上與標(biāo)準(zhǔn)株相比存在著顯著的差異，故需要大量制備中國(guó)株B19 病毒VP1 蛋白作為抗原，為制備特異性診斷試劑和疫苗創(chuàng)造條件。 研究目的: 本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)是在構(gòu)建B19病毒VP1基因原核表達(dá)載體基礎(chǔ)上大量表達(dá)VP1蛋白，進(jìn)一步對(duì)VP1

4、 蛋白進(jìn)行純化，以純化蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物制備其單克隆抗體，檢測(cè)VP1 蛋白的免疫原性及其單克隆抗體的免疫活性，為以后研究VP1 蛋白的生物學(xué)功能，和B19 病毒的防治奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.首先通過(guò)酶切、電泳鑒定我們已構(gòu)建的VP1-PUC19 質(zhì)粒，將VP1 片斷連接質(zhì)粒PQE30，用氯化鈣法制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，送菌測(cè)序。 2.運(yùn)用IPTG 誘導(dǎo)含有VP1-PQE30 質(zhì)粒的發(fā)酵培養(yǎng)菌株表達(dá)VP1

5、融合蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE 和Western-blot 技術(shù)分析蛋白表達(dá)情況及鑒定表達(dá)蛋白，利用AKTA explorer 100 快速純化系統(tǒng)純化表達(dá)蛋白。 3.以純化的蛋白作為抗原，免疫BALB/c 小鼠，末次加強(qiáng)免疫后3d 取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 進(jìn)行融合，經(jīng)HAT 選擇培養(yǎng)，通過(guò)ELISA 反復(fù)篩選陽(yáng)性克隆，有限稀釋法進(jìn)行5 次以上的亞克隆，得到的穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株后用Western-bl

6、ot 鑒定其特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.VPl-PUC19 經(jīng)BamHI 和SalI 雙酶切可切出分子量約480bp 的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌M15 測(cè)序結(jié)果證實(shí)序列完全正確。 2.含有VP1-PQE30 質(zhì)粒的菌株經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo)，可表達(dá)分子量約為22KD 的蛋白，經(jīng)Western-blot 鑒定，均可與6-His 抗體結(jié)合，為VP1 融合蛋白。 3.經(jīng)AKTA explorer 1

7、00 快速純化系統(tǒng)純化表達(dá)的融合蛋白，收獲復(fù)性蛋白75g，純度達(dá)95％以上。 4.反復(fù)篩選獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株:LI 和ZH；Western- blot 結(jié)果顯示該單抗有較強(qiáng)的特異性。 結(jié)論: 1. 成功構(gòu)建了人細(xì)小病毒B19 XA 株VPl 基因的原核表達(dá)系統(tǒng)VP1-PQE30-M15. 2. 用發(fā)酵罐培養(yǎng)含有VP1-PQE30 的大腸桿菌M15，可誘導(dǎo)B19 病毒VP1蛋白大量表達(dá)