人細(xì)小病毒B19VP2蛋白的優(yōu)勢表達(dá)與抗原活性檢測.pdf

1、研究目的： 人細(xì)小病毒B19與人類多種疾病發(fā)生有密切關(guān)系，可引起特發(fā)性血小板減少性紫癜、急性再生障礙性貧血、幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過敏性紫癜等多種疾病，并可造成胎兒水腫、死胎、流產(chǎn)和先天畸形，給患者生命和健康造成嚴(yán)重影響。B19病毒基因組主要編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白VPl(85KDa)和VP2(58KDa)以及一種非結(jié)構(gòu)蛋白NS(77KDa)。VPl和VP2均具有抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的Igm和IgG抗體，可用于B19病毒感染的診斷。免

2、疫功能正常兒童感染B19病毒后可產(chǎn)生特異性抗體，B19-VP2-IgM陽性提示近期感染或急性感染，發(fā)病后3天即可檢出，2-3周達(dá)高峰，持續(xù)2-3個月，適用于B19病毒感染的早期診斷。但由于B19病毒抗原來源困難，國內(nèi)相關(guān)的血清學(xué)檢測試劑很少，臨床診斷大都采用昂貴的國外進(jìn)口ELISA試劑盒。 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得許多病毒衣殼蛋白能夠在體外進(jìn)行基因重組表達(dá)，這也為解決B19病毒抗原來源難的問題開辟了一條新的途徑。本研究通過對B1

3、9病毒VP2序列的生物信息學(xué)分析，選定VP2片段中4354-4662bpf309bp，351．454位氨基酸)表面易得性較高的片段作為研究對象，利用分子生物學(xué)方法獲得VP2基因片段及重組的VP2蛋白，再利用ELISA方法對該重組蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行初步分析。 研究內(nèi)容與結(jié)果： 1.細(xì)小病毒B19VP2基因片段克隆與序列分析 通過引物合成及PCR方法合成了目的片段，擴(kuò)增出309bp的基因片段，測序結(jié)果與選定的B19

4、病毒VP2序列一致，成功構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMDl8-T-VP2。 2．原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)表達(dá)載體多克隆酶切位點信息重新設(shè)計引物，用新設(shè)計的引物再次擴(kuò)增VP2基因片段，經(jīng)酶切處理后插入pGEX-4T-2載體的BamHI和SalI酶切位點之間，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VP2，由于選用的載體在多克隆位點前融合有GST基因序列，當(dāng)目的基因表達(dá)時，就與GST形成融合蛋白，可以幫助目的蛋白正確折疊。 3．融合蛋白的表達(dá)與

5、純化 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(入DE3)工程菌并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量約為37kDa左右，符合預(yù)期大小。SDS-PAGE電泳顯示，融合蛋白主要以包涵體的形式存在，改變誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及換用不同的宿主菌等條件均未增加蛋白的溶解。用8mol／L的脲溶解包涵體，經(jīng)GSTrap阡(1m1)親和樹脂純化后，雖然還含有少許其它雜蛋白，但以B19病毒VP2融合蛋白為主，純度較高。 4．融合蛋白抗原活性初

6、步分析 采用ELISA方法對初步純化的融合蛋白進(jìn)行了抗原活性分析，并與德國SERIONELISA試劑盒進(jìn)行了比較。用本研究中獲得的重組蛋白VP2(5ug／m1)包被酶標(biāo)板，共檢測了46份兒童血清標(biāo)本中的IgM抗體，其特異度和靈敏度分別為100％和60％，與SERIONKit的一致率為93．4％。研究結(jié)果表明，在檢測B19病毒特異性抗體(IgM)方面，本研究獲得的重組蛋白VP2活性較好，而敏感性較低的原因可能與配體蛋白GST有關(guān)。