柑桔裂皮類病毒快速檢測技術的研究及湖北分離物的克隆.pdf

1、該研究采用聚丙酰胺雙向凝膠電泳、反轉錄-PCR和核酸雜交三種方法對柑桔裂皮類病毒進行了快速檢測方法的研究,并成功地分離到了柑桔裂皮類病毒的湖北分離物,對春進行了鑒定和序列分析,具體研究結果如下:1、柑桔裂皮類病毒快速檢測技術體系的建立聚丙燃酰胺雙向凝膠電泳法檢測:將從陽性材料上提取的類病毒核酸,先在6﹪的聚丙烯酰胺非變性膠上進行第一向電泳,然后切割含類病毒分子的膠條,在變性條件下進行垂直或反向電泳,最后銀染觀察.試驗發(fā)現(xiàn),陽性樣品的落后

2、于寄主植物核酸帶的位置均可見一條類病毒分子帶,而陰性對照則沒有這條帶.該方法具有快速簡便、經濟實用的特點.反轉錄-PCR檢測:參考已報道的CEVd核苷酸序列合成引物,分別對中柑所和意大利陽性樣品進行RT-PCR擴增,然后進行瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)在370bp左右的位置上有特異性擴增條帶,而且可以應用于待檢樣品的檢測.該檢測方法特異性強、敏感性高,檢測結果穩(wěn)定、可靠,尤其適合于田間樣品的大規(guī)模檢測.核酸雜交法檢測:利用已經克隆的美國柑桔裂皮

3、類病毒cDNA序列,制備生物素標記的核柑酸探針,采用班點雜交的方法和組織印跡的方法分別對陽性材料進行雜交檢測,通過膠片曝光顯示雜交信號,發(fā)現(xiàn)在兩種方法的檢測結果中陽性材料都有強的反應,而陰性材料無反應或較弱,該方法安全可靠、快速準確,適合大量樣品的檢測.2.柑桔裂皮類病毒湖北株系的分離鑒定與測序從湖北省秭歸縣采集羅伯遜臍橙枝條,采用聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳、RT-PCR及Dot-blotting方法檢測到了柑桔裂皮類病毒,然后將其嫁接于指