陸地棉T-DNA插入紅色突變體分子機(jī)理的初步研究.pdf

1、棉花是目前世界上附加值最高的天然紡織纖維，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的90％來(lái)自于棉纖維。但陸地棉是異源四倍體，基因組結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，棉花基因組學(xué)的研究也非常緩慢，而通過(guò)T-DNA插入突變研究棉花的功能基因尚未報(bào)道。
　　 本研究以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入獲得的紅色突變體為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)Southern Blot分析已經(jīng)初步確定紅色突變體為外源T-DNA的單拷貝插入，從而開(kāi)展棉花紅色突變分子機(jī)理的初步研究。該紅色突變體整株都呈紅色，并具有優(yōu)良的

2、抗蟲(chóng)性，棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)相比背景植株沒(méi)有差異。紅色突變體在自然光的條件下從出土、成苗、開(kāi)花、結(jié)鈴等整個(gè)生育期的組織器官都呈現(xiàn)紅色;但在植物培養(yǎng)室內(nèi)的人工光照條件下，則新長(zhǎng)出的莖葉變?yōu)榫G色，移至棉花田接受自然光照，一天后又呈現(xiàn)紅色。首先利用Tail-PCR分離T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，是一段沉默的gypsy類逆轉(zhuǎn)座子3'末端;利用cDNA-AFLP分析突變體和背景植株差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)大部分屬于該區(qū)域處附近的gypsy類逆轉(zhuǎn)座子及附

3、近區(qū)域基因。分析發(fā)現(xiàn)T-DNA側(cè)翼序列下游為兩個(gè)緊密相連的基因，即植物類黃酮甲基化轉(zhuǎn)移酶基因(Flavonol3-O methyltransferase，記為GhFOMT)和光系統(tǒng)Ⅱ蛋白基因(PhotosystemⅡ，記為GhPⅡ)，這兩個(gè)基因的上游緊接gypsy類逆轉(zhuǎn)座子，均無(wú)啟動(dòng)子等調(diào)控元件。初步推斷是由于插入的外源T-DNA上攜帶的CaMV(::)35S啟動(dòng)子激活下游基因的表達(dá)，即GhFOMT和GhPⅡ基因過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致體內(nèi)花青素大

4、量累積，從而使棉花突變體呈現(xiàn)紅色?？寺〕鯣hFOMT和GhPⅡ兩個(gè)基因，并構(gòu)建超表達(dá)載體(pB7WG2D)。利用農(nóng)桿菌LB4404轉(zhuǎn)化到擬南芥中進(jìn)行基因功能的初步驗(yàn)證，進(jìn)而轉(zhuǎn)化陸地棉Coker312。
　　 測(cè)定突變體和背景植株的葉綠素和花青素的含量發(fā)現(xiàn)，紅色突變體葉綠素含量相對(duì)于其背景植株差異不顯著，但花青素含量極顯著高于背景植株。利用Realtime PCR檢測(cè)GhFOMT和GhPⅡ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紅色突變體中這兩個(gè)基因的表達(dá)量

5、極顯著高于背景植株，在背景植株有微量表達(dá)。這初步說(shuō)明紅色突變可能由這兩個(gè)基因的過(guò)量表達(dá)所致。通過(guò)對(duì)GhFOMT基因和GhPⅡ基因分析，發(fā)現(xiàn)FOMT基因所編碼的類黃酮甲基化轉(zhuǎn)移酶是植物花青素合成代謝途徑中把無(wú)色花青素苷修飾為有色花青素苷的三個(gè)關(guān)鍵酶之一，在植物花青素苷的合成過(guò)程中起關(guān)鍵的作用;而PⅡ?qū)儆谌~綠素a/b結(jié)合蛋白超家族成員，在光吸收中起重要作用，與植物光信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)。因此GhPⅡ可能參與GhFOMT調(diào)控的花青素苷的合成過(guò)程中