香菇Swollenin的異源轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變體庫的建立.pdf

1、香菇（Lentinusedodes）是產(chǎn)量僅次于雙孢菇的世界第二大食用菌栽培菌種，是一種重要的藥食兩用真菌，不但具有很高的營養(yǎng)價值，而且還具有許多重要的醫(yī)藥保健功能，有著廣闊的國內(nèi)國際市場，潛力巨大。目前香菇的品種選育技術還是較多的采取傳統(tǒng)的誘變雜交等育種方法，利用轉(zhuǎn)基因等分子生物學技術選育香菇新品種的研究還處于起步階段，同時香菇的全基因組測序工作尚未完成，基因功能方面仍未有成熟的研究手段。本論文運用PEG介導轉(zhuǎn)化法和根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化

2、法對香菇菌株申香10號進行了外源基因的轉(zhuǎn)化，根據(jù)T-DNA隨機插入的特點建立一個小規(guī)模的T-DNA插入突變體庫，采用正反向遺傳學相結合的策略對突變株進行基因水平的研究，深入了解基因的功能。
　　 1、以質(zhì)粒載體pCAMBIA1302為骨架構建了含有香菇強啟動子gpd和擬康氏木霉Swollenin基因的雙元載體pLGS，通過潮霉素敏感性實驗確定實驗中初篩的潮霉素濃度為10μg/mL，復篩時的濃度為15μg/mL。采用PEG介導轉(zhuǎn)化

3、法對香菇菌株申香10號進行轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR和點雜交驗證swo已經(jīng)整合到香菇基因組中，并且能夠穩(wěn)定遺傳，但是轉(zhuǎn)化率比較低，假陽性率高，僅為1個轉(zhuǎn)化子/μgDNA。將得到的香菇轉(zhuǎn)化株進行栽培試驗，轉(zhuǎn)化株1能夠表現(xiàn)出一些優(yōu)良的生物學性狀，生長速度達到0.37cm/d，比原菌株提高了32.14％，產(chǎn)量達到578.36g/袋，與原菌株相比提高了4.68％，平均單菇重量達到58.34g。
　　 2、構建含有香菇同源gpd啟動子的雙元載體pLG

4、F，將該載體導入農(nóng)桿菌EHA105后，與香菇菌株申香10號的菌球進行共培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化株，建立起具有122個轉(zhuǎn)化株的小型的T-DNA突變體庫，并進行了分子驗證。同時在不同的轉(zhuǎn)化條件下(農(nóng)桿菌濃度OD660為0.2-0.5，AS濃度為200-300μM，共培養(yǎng)時間為2-4d)香菇的轉(zhuǎn)化率不同，同PEG轉(zhuǎn)化法相比，轉(zhuǎn)化率明顯提高，達到18-20％，假陽性率低。
　　 3、根據(jù)發(fā)表的真菌三條簡并引物和T-DNALB

5、與RB區(qū)序列設計的特異引物，用簡并引物與特異引物組合采用TAIL-PCR的方法對農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化株T-DNA插入位點的側翼序列進行克隆，三輪PCR后會得到0.7-1.0kb大小的片段30個，其中22個的轉(zhuǎn)化株和引物組合都能獲得清晰的條帶進行測序，并將得到的序列進行Blast分析比對，其中簡并引物AD3與LB區(qū)的特異引物組合和其中的一個轉(zhuǎn)化子可以擴增出的0.7kb片段，和樟芝的mnsod基因有一定的同源性，但是相似度不高，僅為4％