棉花t-DNA插入突變體側(cè)翼序列分析與雙t-DNA載體系統(tǒng)構(gòu)建.pdf

1、棉花(Gossypium L.)是我國主要的纖維作物，也是第五大油料作物。棉花主要產(chǎn)品纖維是紡織業(yè)的重要原料，也是必需的生活物資。因此，進(jìn)行棉花功能基因的研究顯得尤為必要。突變體是開展植物功能基因組學(xué)研究中的重要材料，利用Genetrap系統(tǒng)構(gòu)建植株表達(dá)載體，借助農(nóng)桿菌進(jìn)行T-DNA的插入是創(chuàng)制突變體的有效策略。T-DNA標(biāo)簽的插入不僅擾亂了植物自身基因的正常表達(dá)，而且該“標(biāo)簽”序列已知，使得可以相對簡單、快捷的分離被破壞的基因序列，然

2、后進(jìn)行該基因的功能研究。同時，轉(zhuǎn)Bt棉花的長時間使用使得昆蟲對其產(chǎn)生一定的抗性，獲得更多的Bt棉材料或多價Bt棉材料顯得尤為重要。
　　創(chuàng)制突變體利用Promoter trap系統(tǒng)構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體，借助農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造棉花突變體材料。然后檢測不同轉(zhuǎn)化株表達(dá)模式、拷貝數(shù)，分離其側(cè)翼序列，分析T-DNA整合位點，獲得該位點生物信息，結(jié)合突變株表型進(jìn)行該基因的功能研究。創(chuàng)造轉(zhuǎn)Bt棉花材料和獲得Free-marker轉(zhuǎn)基因棉花利用

3、雙T-DNA載體系統(tǒng)。為了驗證雙T-DNA載體系統(tǒng)在棉花中的實用性及能夠獲得抗蟲棉花轉(zhuǎn)基因材料，本研究通過構(gòu)建雙T-DNA植物表達(dá)載體，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptⅡ)為標(biāo)記基因，利用農(nóng)桿菌進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，使用卡拉霉素(Kan)篩選，獲得轉(zhuǎn)基因棉花。實驗主要獲得以下結(jié)果:
　　(1)目前已獲得Promoter trap T0轉(zhuǎn)化株1000余株，67.47％轉(zhuǎn)化進(jìn)行PCR檢測為陽性株;已收獲800余份后代種子。Southem雜交結(jié)果

4、表明，單拷貝占到50.56％，平均每個轉(zhuǎn)化株含有1.83個T-DNA標(biāo)簽。
　　(2)利用FPNI-PCR技術(shù)分離棉花T-DNA標(biāo)簽側(cè)翼序列，依賴左邊界分離的側(cè)翼序列有274條，其中152條定位到棉花基因組上，定位率為55.47％;依賴右邊界分離的側(cè)翼序列有336條，其中193條定位到棉花基因組上，定位率為57.44％。
　　(3)研究T-DNA側(cè)翼序列在棉花基因組中轉(zhuǎn)移特點發(fā)現(xiàn)，在右邊界插入整合過程中，極易保留右邊界重復(fù)序

5、列3bp，從腺嘌呤(A)處剪接，占到總數(shù)的23.51％。總體來說，T-DNA末端整合多從A或T堿基處剪接，左邊界缺失程度重于右邊界。
　　(4)研究T-DNA側(cè)翼序列在棉花基因組中分布特點得出，T-DNA側(cè)翼序列對A、D亞基因組沒有顯著的偏好性，T-DNA偏好整合到基因區(qū)與轉(zhuǎn)座因子區(qū)，在TE區(qū)中偏好整合到LTR轉(zhuǎn)座因子區(qū)域中。
　　(5)以pCAMBIA2300S為基礎(chǔ)載體，以pBI121載體中的“Nos-T-DNA-LB”

6、為模板，設(shè)計特異引物，在引物兩端分別加上合適的酶切位點及在左邊界端加上T-DNA區(qū)右邊界重復(fù)序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得“Nos-LB-RB”的DNA片段，用T4酶連接重組，獲得含有雙T-DNA的重組中間載體pCAMBIA2300SDT。
　　(6)在pCAMBIA2300SDT重組中間載體基礎(chǔ)上，分別以mGFP5*/cry1C*基因為模板設(shè)計引物，添加合適的酶切接頭，經(jīng)T4酶重組連接獲得含有mGFP5*/cry1C*基因的雙T-DNA