水稻T-DNA插入黃葉突變體基因克隆與功能分析.pdf

1、葉綠體的正常發(fā)育需要控制葉片發(fā)育及編碼葉綠體蛋白的核基因與編碼自身蛋白的葉綠體基因之間的相互協(xié)調(diào).這些基因的突變將導(dǎo)致葉綠體發(fā)育的缺陷、葉綠素合成減少,葉色變異等.作為一種易于觀(guān)察的性狀突變,葉色突變體是研究光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控機(jī)制的理想材料.本研究以轉(zhuǎn)綠型水稻T-DNA插入黃葉突變體vyl(virescent yellow leaf.vyl)為材料,研究了其遺傳規(guī)律、光合特性、突變基因及其功能,從植物生理和分子水平上初步闡明了v

2、yl突變體的突變機(jī)理,為vyl突變體在水稻光合生理、功能基因組學(xué)研究和生產(chǎn)等方面的利用提供了理論依據(jù).另外,本研究還對(duì)水稻T-DNA插入黃葉突變體yl(yellow leaf,yl)在不同光照條件下的光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)活性與色素組成進(jìn)行了分析,明確了光照強(qiáng)度對(duì)其光合特性的影響,為探討yl突變體的突變機(jī)理及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下: 1.vyl突變體鑒定與遺傳分析表明,vyl突變體為單隱性核基因控制的T-DNA插入突變體,

3、且只有一個(gè)T-DNA插入拷貝.其未展開(kāi)葉呈乳黃色,葉片展開(kāi)后葉色從葉尖向葉基部開(kāi)始轉(zhuǎn)綠,但完全轉(zhuǎn)綠的葉片仍比野生型淺綠.vyl突變體的這種表型在整個(gè)葉片生長(zhǎng)發(fā)育期間保持穩(wěn)定不變.vyl突變體植株較野生型矮小,能正常生長(zhǎng)和結(jié)實(shí),是國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道的一種新型水稻葉色突變體. 2.vyl突變體的光合特性研究結(jié)果表明,vyl突變體是一個(gè)葉綠素b減少型突變體,其倒二葉葉綠素a、葉綠素b、β-內(nèi)胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均顯著低于野生型,但其葉

4、綠素a/b比值高于野生型;隨著葉片的發(fā)育,其葉綠體發(fā)育較野生型顯著滯后.2d野生型倒二葉的葉綠體己發(fā)育成熟(以心葉生長(zhǎng)出的第一天為Od),有一個(gè)完整的內(nèi)囊體膜體系,葉綠體結(jié)構(gòu)完整,基粒片層豐富,而對(duì)應(yīng)vyl突變體葉片的葉綠體基粒垛疊減少,即使12d完全轉(zhuǎn)綠的vyl突變體倒二葉葉綠體,基粒片層仍明顯少于2d野生型.雖然vyl突變體的光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學(xué)效率與野生型之間無(wú)明顯差異,但其PSⅡ的事實(shí)光化學(xué)效率(ФPSⅡ)、電子傳遞

5、速率(ETR)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)較野生型顯著減少,表明其光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的供體側(cè)和受體側(cè)的光化學(xué)活性均受到了嚴(yán)重抑制:vyl突變體光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心蛋白CP43,CP47,D1,D2和LHcⅡ蛋白較野生型顯著減少,更多的葉綠素參與其光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)色素蛋白復(fù)合體的形成. 3.采用PCR-Walking方法,從vyl突變體植株中獲得了T-DNA插入位點(diǎn)的右翼序列,對(duì)右翼序列進(jìn)行bla

6、st比對(duì)及T-DNA插入與表型的共分離驗(yàn)證,獲得vyl突變體候選基因VYL,確定VYL,位于水稻第9染色體,T-DNA插在其第一個(gè)外顯子起始密碼子下游64bp處.根據(jù)VYL的ORF及其EST序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,獲得了VYL全長(zhǎng)cDNA.經(jīng)轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證,確定VYL,為vyl突變體目的基因.VYL是一個(gè)新的葉色突變基因,具有一含有鋅指結(jié)構(gòu)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶互作蛋白功能域.AIR1.在水稻中,AIR1主要存在于基因編碼

7、產(chǎn)物分別為鋅指蛋白、逆轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄元件類(lèi)似蛋白和一種假定蛋白4類(lèi)基因中,具有翻譯后修飾的功能,在調(diào)節(jié)核基因的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)中也具有重要作用;VYL,基因在根中表達(dá)較弱,在葉中表達(dá)較強(qiáng),在莖中的表達(dá)中等;除了在2d未展開(kāi)的倒二葉中表達(dá)稍弱外(以心葉生長(zhǎng)出的第一天為Od),VYL,基因在4d、6d、8d和12d倒二葉中均較強(qiáng)表達(dá),說(shuō)明VYl基因不存在時(shí)空表達(dá)特異性.采用GFP標(biāo)簽技術(shù)和基因槍轉(zhuǎn)化法將VYL基因轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞,將VYL基因

8、定位在細(xì)胞質(zhì)中,這與AIRl具有翻譯后修飾的功能一致. 4.yl 突變體是一個(gè)葉綠素b減少型的突變體,在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間始終表現(xiàn)為淺黃色的葉色表型,其葉綠體類(lèi)囊體膜和基粒片層較野生型顯著減少.在微弱的光照條件下(50μmol photonsm<'-2>S<'-2>),其色素含量、事實(shí)光化學(xué)效率(OPSII)、光化學(xué)淬滅(qp)和光下開(kāi)放的反應(yīng)中心捕獲的激發(fā)能效率(Fv'/Fm,)顯著低于野生型,但其Chl a/b比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野