水稻T-DNA插入突變體庫的篩選及與水稻穎花穎殼發(fā)育相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、T-DNA標(biāo)簽是一種高通量的分離和克隆植物功能基因的方法，目前在擬南芥等雙子葉植物中已得到廣泛應(yīng)用，但在水稻等單子葉植物中尚處于探索階段。本文通過對4416份T1代水稻T-DNA標(biāo)簽系的篩選，對T-DNA插入產(chǎn)生的突變類型、不同性狀的突變頻率、表型突變體的篩選程序、T-DNA側(cè)翼序列的分離方法及整合特性等進行了研究和探討；對獲得的一個穎花穎殼缺失的突變體，進行了對應(yīng)基因的克隆、功能驗證、表達模式分析；對一個多重穎殼突變體開展了形態(tài)學(xué)觀察

2、和初步遺傳分析。獲得的主要研究結(jié)論有： 1、對以中花11(ZH11)、中花15(ZH15)為受體親本構(gòu)建的4416份T1代標(biāo)簽系進行了表型鑒定，發(fā)現(xiàn)存在擬純合突變和系內(nèi)分離突變兩種類型；突變表型涉及株高、生育期、葉形、葉色、分蘗力、植株松緊度、穗頸節(jié)、穗形、穎花、粒形、類病變、雄性不育、生長極性等14類性狀。其中，株高、生育期、葉色、雄性不育等性狀有著相對較高的突變頻率(＞1％)，株高和葉色的突變頻率在品種及年度間表現(xiàn)穩(wěn)定，而生

3、育期、雄性不育波動較大，表明這類性狀的表型易受環(huán)境影響。通過T1、T2連續(xù)世代的共分離分析，初步篩選出3個與穗部或穎花發(fā)育相關(guān)的T-DNA插入突變體，其頻率約為1.37‰。為分離相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)。 隨機選擇42份有表型突變的標(biāo)簽系，通過質(zhì)粒拯救和TAIL-PCR的方法，從39個標(biāo)簽系中分離獲得40條T-DNA側(cè)翼序列，其中26條為載體序列，14條與水稻基因組有很好的同源性，Blastn分析結(jié)果表明T-DNA有優(yōu)先整合進植物功

4、能基因內(nèi)部的特性。 建立的質(zhì)粒拯救和TAIL-PCR兩種分離T-DNA側(cè)翼序列的方法，相比較而言，前者對某個特定標(biāo)簽系，篩選含有T-DNA側(cè)翼序列的陽性克隆獲得率及測序效率較高，分離片段較長，但對DNA質(zhì)量要求較高，操作過程繁瑣，工作量較大；而后者對大規(guī)模分離側(cè)翼序列、建立側(cè)翼序列庫而言擴增效率較高，且操作簡單、方便、快捷，但就某個特定標(biāo)簽系特異PCR產(chǎn)物的獲得率相對較低，且分離的序列片段一般長度較短。兩種方法結(jié)合使用，對某個特

5、定標(biāo)簽系其側(cè)翼序列的分離就會有很大的幾率。 2、對一個初步確認(rèn)的穎花穎殼退化的T-DNA插入突變體(degeneratedhull1，dh1)，開展了基因克隆和功能分析研究。解剖鏡觀察結(jié)果表明dh1突變體表現(xiàn)為大部分穎花(≈70％)的內(nèi)、外稃缺失，同時伴有雌雄蕊數(shù)目的異常，少量穎花(≈30％)的內(nèi)、外稃表型正常，但雌雄蕊發(fā)育畸形。掃描電鏡和石蠟切片的結(jié)果顯示dh1突變體能進行正常的幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗的分化和發(fā)育，進入

6、穎花器官分化后，部分穎花雖然能分化出護穎，卻在內(nèi)、外稃的分化上表現(xiàn)為功能的缺失：部分穎花內(nèi)、外稃發(fā)育提前終止或滯后于雌雄蕊的發(fā)育，部分穎花表現(xiàn)出不均衡分裂而產(chǎn)生數(shù)目異常的雄蕊，部分穎花雌蕊異常發(fā)育而呈現(xiàn)多柱頭或2朵小花的雌雄蕊器官分化后融合在一起的異?，F(xiàn)象。上述結(jié)果表明DH1基因?qū)Ψf花內(nèi)外稃的形態(tài)建成具有重要作用，同時與雌雄蕊的分化、發(fā)育也相關(guān)。 Southernblotting結(jié)果顯示T-DNA在dh1突變體中僅有1個拷貝。通

7、過TAIL-PCR的方法，獲得了全長361bp的T-DNA側(cè)翼序列，Blastn結(jié)果顯示其對應(yīng)于粳稻日本晴第2染色體的PAC克隆“P0474F11”的一段序列，基因預(yù)測結(jié)果顯示T-DNA插入到了距一個預(yù)測功能基因的、轉(zhuǎn)錄起始點上游283bp的位點。通過T-DNA序列的特異引物與T-DNA插入位點兩側(cè)的基因組引物的不同配對進行PCR擴增，驗證了側(cè)翼序列與突變表型共分離。在幼穗分化期取樣進行RT-PCR分析，結(jié)果顯示dh1突變體目標(biāo)候選基因

8、(DH1)的轉(zhuǎn)錄水平較野生型明顯降低。因而，初步確認(rèn)T-DNA片段插入到目標(biāo)基因DH1的啟動子附近或重要調(diào)節(jié)序列之中，而產(chǎn)生了功能喪失突變。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，DH1編碼的氨基酸序列含有保守的LOB(Lateralorganboundaries)結(jié)構(gòu)域，同時能形成卷曲螺旋(Coiledcoil)二級結(jié)構(gòu)，為典型的LBD(LOBdomaingenes)基因家族成員。 對DH1基因的RNAi可部分再現(xiàn)dh1突變體的表型，功能互補試驗

9、則表明野生型DH1基因能恢復(fù)dh1突變體的表型，從而對DH1基因的功能進行了可靠驗證。DH1基因的原位過量表達，可導(dǎo)致產(chǎn)生植株矮小、穗軸和枝梗變短、葉片下垂等表型，與擬南芥中部分LBD基因過量表達的表型具有相似性。通過構(gòu)建pDH1：：GFP的融合表達載體，研究目標(biāo)基因的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DH1不僅具有僅在腋芽和幼穗中表達，而不在根、葉、節(jié)或節(jié)間等器官中表達的空間特性，同時還有在幼嫩器官中較強表達、而在發(fā)育成熟器官中減弱表達的時間特性。

10、 dh1突變體在長光照條件下抽穗比在短光照條件下抽穗有更嚴(yán)重的穎花穎殼缺失。對DH1基因的啟動子區(qū)域進行信號調(diào)控元件分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在大量的光調(diào)控元件，從而暗示有兩種可能：一是DH1基因在長光照條件下表達量相對較低，T-DNA插入進一步下調(diào)其表達，而產(chǎn)生較明顯的突變表型；而在短光照條件下，DH1基因表達量相對較高，T-DNA插入盡管下調(diào)其表達，但仍有一定的絕對表達量，因而其對穎花穎殼及其內(nèi)部器官的分化影響較小，突變表型相對較輕。

11、二是DH1基因的表達受長光照條件的誘導(dǎo)，T-DNA插入下調(diào)其表達，產(chǎn)生穎花穎殼退化表型：同時，短光照條件可誘導(dǎo)與DH1功能冗余的相關(guān)基因的表達，能夠部分補償DH1喪失突變的功能，從而使dh1突變體在短光照條件下能夠部分恢復(fù)正常表型。 大多數(shù)已克隆的控制穎花器官發(fā)育的基因均屬于MADS-box基因家族。選擇與水稻穎花器官發(fā)育相關(guān)的5個MADS-box基因進行RT-PCR分析，結(jié)果顯示其在dh1突變體與野生型對照中的表達完全一致，初

12、步揭示DH1基因可能涉及了非MADS-box基因的功能信號途徑而參與對穎花構(gòu)成器官的發(fā)育調(diào)控。 本研究克隆的DH1基因，是一個典型的LBD基因，這是在水稻上首次證明LBD基因參與水稻穎花的發(fā)育調(diào)控，該基因的克隆及功能驗證對闡明和豐富水稻穎花發(fā)育的分子調(diào)控理論具有重要意義。同時，穎花的發(fā)育是水稻產(chǎn)量、品質(zhì)形成的基礎(chǔ)。了解DH1與其它控制穎花器官發(fā)育基因的相互作用，將為提高稻谷產(chǎn)量、改進稻米品質(zhì)提供理論依據(jù)。此外，本研究通過T-DN

13、A標(biāo)簽方法成功分離了DH1基因，為在水稻等單子葉植物的功能基因組分析中大規(guī)模應(yīng)用該技術(shù)提供了試驗論證。 3、從T-DNA插入突變體庫中篩選獲得一個多重穎殼突變體(multipleglumes，mg)。解剖鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)外稃伸長，同時伴有類穎殼狀結(jié)構(gòu)而普遍呈現(xiàn)多重穎殼；14.27％的穎花沒有雌、雄蕊，23.72％的穎花包含有額外小花，62.01％的穎花其雌、雄蕊數(shù)目異常，分別變化在1-3枚和1-9枚之間，部分穎花的花絲基部可看

14、到泡狀透明瘤狀物；突變體漿片稃片化而使其穎花在自然條件下不能開放，完全雄性和雌性不育。掃描電鏡和石蠟切片結(jié)果觀察揭示其幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗原基分化正常，但進入穎花分化后，其雌、雄蕊原基的分化較遲，會繼續(xù)進行類似多重穎殼狀器官的分化；同時，穎花原基進行不均衡分裂，產(chǎn)生數(shù)目不等的雌、雄蕊。遺傳分析顯示該突變是一個單基因控制的隱性性狀，并與T-DNA插入表現(xiàn)共分離。推斷其是E類基因引起的功能突變。在獲得側(cè)翼序列并驗證其與突變表型共分