希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫的構建、篩選及相關突變體基因的克隆.pdf

1、希金斯刺盤孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它屬于子囊菌亞門,是一種半活體營養(yǎng)型的病害真菌。本研究以希金斯刺盤孢Ch-1菌株為出發(fā)菌株,利用農桿菌介導轉化法獲得2000多個T-DNA隨機插入突變體,為進一步研究病原菌的致病機理提供了必要的材料。通過對突變體進行生物學特性分析,并以擬南芥為寄主植物做致病性測定,對突變體進行了初步篩選并將其分類,其中,2株生長緩慢,菌落不能

2、均勻擴展；4株致病性減弱；3株產孢缺陷,在PDA平皿上不能產生分生孢子；4株產孢量增多；2株可以誘導寄主產生過敏性壞死；13株色素異常；2株菌落扇變；3株附著孢萌發(fā)異常。
　　 對突變體Pch-1E393和Pch-1C36進行了深入詳細的研究。突變體Pch-1E393生長速度明顯減慢,菌絲粗壯稀疏,與Ch-1相比差異顯著,但對擬南芥的致病力與菌株Ch-1無顯著差異,此突變體在侵染過程中能產生正常的黑色附著孢并能產生初生菌絲和次生

3、菌絲。Southern雜交證實在Pch-1E393中T-DNA標記為雙拷貝插入。采用反向PCR技術對突變體Pch-1E393中T-DNA標記插入位點的側翼基因組序列進行克隆,經過序列分析,表明T-DNA插入破壞的基因包含一個1432bp的完整開放閱讀框,包含三個內含子、四個外顯子,編碼一個352個氨基酸的蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(blsatp),發(fā)現該序列與禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的減

4、數分裂重組蛋白DMC1(meiotic recombination protein DMC1)具有高度同源相似性,相似度為86％,此蛋白在減數分裂過程中參與同源重組。
　　 突變體Pch-1C36菌落灰白色,菌落中間呈黑色并塌陷,與Ch-1的菌落形態(tài)差異明顯,但致病性、生長速度、孢子產量等其他生物特性與Ch-1無明顯差異。Southern雜交證實T-DNA標記在Pch-1C36中為雙位點插入。采用反向PCR技術對突變體Pch-1

5、C36中T-DNA標記插入位點的側翼基因組DNA進行克隆,經過序列分析,表明T-DNA插入破壞的基因包含一個690bp的完整開放閱讀框,包含兩個內含子、三個外顯子,編碼一個174個氨基酸的蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(blsatp),發(fā)現該序列與endofibonuclease L-PSP(liver perchlofic acid-soluble protein)同源性最高,L-PSP是在老鼠中,第一個被鑒定為單鏈RNA