水稻T-DNA插入突變體庫(kù)側(cè)翼序列的分離和OsBClL家族基因的功能研究.pdf

1、隨著水稻基因組測(cè)序的完成,水稻基因組學(xué)研究已經(jīng)步入功能基因組學(xué)時(shí)代。為了在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析水稻基因的功能,最直接有效的方式是構(gòu)建大量的突變?nèi)后w,然后利用正向遺傳學(xué)或反向遺傳學(xué)策略進(jìn)行基因功能的研究。對(duì)于T-DNA或轉(zhuǎn)座子等插入型突變體的基因克隆,無論采用正向遺傳學(xué)方法或采用反向遺傳學(xué)方法,都必須分離插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。通過建立側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫(kù),人們可以很容易地檢索到目的基因的突變體,從而進(jìn)行基因克隆。
　　 本研究以本實(shí)

2、驗(yàn)室的T-DNA插入突變體庫(kù)為材料,完成了12,432份T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)工作,利用TAIL-PCR技術(shù)分離得到T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列5,082條。COBRA-like蛋白在植物纖維素合成和細(xì)胞擴(kuò)張中具有重要的作用,本研究采用正向遺傳學(xué)與反向遺傳學(xué)相結(jié)合的方法,研究鑒定了水稻中兩個(gè)COBRA-like基因OsBC1L4和OsBC1L5的生物學(xué)功能。本研究還克隆了一個(gè)影響水稻分蘗數(shù)的基因LTW1并進(jìn)行了功能分析。

3、　　 本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.完成12,432份水稻T-DNA插入突變體庫(kù)TO代轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)工作,其中10,770個(gè)家系為T-DNA插入陽(yáng)性植株,T-DNA陽(yáng)性率約為86.6％。
　　 2.對(duì)T-DNA插入陽(yáng)性的家系分離側(cè)翼序列,共計(jì)得到T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列5,082條,其中的2,644條序列與水稻基因組匹配較好(E-value<10-5),基因組定位率約為52.0％。
　　

4、 3.通過對(duì)分蘗突變表型的正向篩選,獲得2個(gè)T-DNA側(cè)翼序列和分蘗突變性狀共分離的家系04Z11EM13(OsBC1L4)和LTW1。
　　 4.對(duì)水稻OsBC1L家族成員進(jìn)行了分子特征、染色體位置、系譜關(guān)系及表達(dá)分析,并通過反向遺傳學(xué)策略,搜集了5個(gè)OsBC1L基因的插入家系,發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因參與水稻花粉的發(fā)育。
　　 5.在04Z11EM13家系中,T-DNA插入到OsBC1L4基因的第4個(gè)外顯子中,造成了

5、分蘗少、矮化的突變表型。通過共分離檢測(cè)和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)克隆了OsBC1L4基因。經(jīng)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)osbc1l4突變體具有不正常的細(xì)胞擴(kuò)張、降低的次生壁厚度和增力的淀粉積累。通過測(cè)定纖維素和木質(zhì)素含量,發(fā)現(xiàn)osbc1l4突變體的纖維素含量下降了24％。采用RT-PCR和組織原位雜交技術(shù)分析了OsBC1L4基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)該基因在薄壁組織和厚壁組織都有表達(dá)。通過進(jìn)行OsBC1L4蛋白的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)該蛋白主要位于細(xì)胞壁和細(xì)胞

6、膜上。通過表達(dá)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)OsBC1L4基因與初生壁形成相關(guān)的纖維素合成酶基因共表達(dá)。用real-time方法檢測(cè)了纖維素合成相關(guān)基因和OsBC1L基因在osbc1l4突變體與野生型中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)在osbc1l4突變體中升高了,這可能反映了纖維素合成過程中的一種反饋機(jī)制,即通過升高其它纖維素合成相關(guān)基因的表達(dá)來彌補(bǔ)osbc1l4突變體中的纖維素?fù)p失。
　　 6.在OsBC1L5家系中,T-DNA插入

7、到OsBC1L5基因的唯一的外顯子中。該Tos17插入家系無純合單株。通過雜合植株與野生型植株的正反雜交,發(fā)現(xiàn)osbc1l5基因型的雄配子缺陷。經(jīng)體外花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因可能參與水稻花粉的萌發(fā)。通過RNAi抑制實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)OsBC1L5基因?qū)λ净ǚ郾诘陌l(fā)育可能也有影響。
　　 7.在LTW1家系中,T-DNA插入到LTW1基因的唯一的外顯子中,造成了分蘗少、易枯萎的突變表型。通過共分離檢測(cè)和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)克隆了LTW1