TPO受體胞內(nèi)區(qū)相互作用蛋白的篩選與初步功能研究.pdf

1、TPO是重要的造血生長因子，主要調(diào)控巨核細胞的增殖和血小板的生成，并能與其它因子協(xié)同作用，支持多能造血祖細胞的存活和分化。TPO通過與細胞膜上的TPO受體(Mpl)結(jié)合而發(fā)揮作用，研究Mpl的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對理解TPO廣泛的生理作用有重要意義。 當TPO與Mpl結(jié)合時，Mpl形成同源二聚體，激活與之結(jié)合的Janus激酶(JAK2)，引起受體胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基的磷酸化，從而引發(fā)下游STAT、Ras/Raf/MAPK、PI3K等多條信

2、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)缺失c-Mpl胞內(nèi)區(qū)近膜的10個氨基酸，TPO與c-Mpl結(jié)合便不能激活JAK2，但Raf、MAPK、PI3K仍可被激活；而去除Mpl胞內(nèi)區(qū)所有酪氨酸殘基，TPO仍可支持TPO依賴細胞株的增殖，這些都說明細胞內(nèi)尚存在其他未被認識的TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。尋找新的介導(dǎo)TPO信號的蛋白質(zhì)是本研究的目的。 我們以Mpl胞內(nèi)區(qū)蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交的方法從小鼠胎肝文庫中釣取了16個可能同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用

3、的基因片段；然后通過哺乳動物細胞內(nèi)雙雜交實驗進一步篩選，去除其中2個在此系統(tǒng)下同Mpl沒有相互作用的片段；在剩余的14個基因片段中，通過對基因的功能和細胞內(nèi)定位分析，選取了8個可能同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用的基因片段繼續(xù)研究，克隆了此8個基因片段的全長序列，并利用哺乳動物細胞內(nèi)雙雜交實驗對全長基因同Mpl的相互作用進行驗證，結(jié)果這8個全長基因同Mpl胞內(nèi)區(qū)均存在相互作用。我們選取其中的兩條基因(RACK1和Atp5d)進行了進一步研究。

4、 RACK1是激活的PKC的受體，具有銜接蛋白的功能，已證實與許多信號分子及受體存在相互作用，可能在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起組織、聚集、調(diào)控信號分子的作用。通過Westernblot實驗檢測RACK1在不同組織與細胞內(nèi)的表達情況，發(fā)現(xiàn)在表達Mpl的細胞和組織內(nèi)RACK1的表達也很豐富；通過免疫共沉淀實驗確定了在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)RACK1同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用；隨后進一步用激光共聚焦顯微鏡觀察RACK1與Mpl蛋白在細胞內(nèi)的定位、共定位，

5、發(fā)現(xiàn)兩者在細胞內(nèi)可表達于相同位置，從而證明RACK1同Mpl蛋白在細胞內(nèi)存在相互作用，并且這種相互作用可能具有一定的生理意義。另外我們還通過RNA干涉及基因的過表達等方法對RACK1在TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)RACK1有可能參與Raf/MAPK通路的正調(diào)控。上述實驗證明RACK1為一新的TPO信號調(diào)控分子并初步揭示了其在TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能，這對完善TPO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、豐富RACK1的研究內(nèi)容都是很有意義的。

6、 Atp5d是ATP合成酶的δ亞基，在ATP合成酶中起定子的作用，保證亞基α3β3不隨γεcring一起旋轉(zhuǎn)。Atp5d游離存在時的功能研究非常少，證明其同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用，對TPO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Atp5d解離狀態(tài)時的功能等方面的研究都有重要意義。我們首先進行了蛋白的原核表達，并在此基礎(chǔ)上制備了Atp5d蛋白的多克隆抗體，經(jīng)過抗體特異性檢測，證明獲得了適用于Westernblot實驗的特異性多克隆抗體；利用此抗體，檢測

7、了Atp5d在不同組織與細胞內(nèi)的表達情況，發(fā)現(xiàn)Atp5d廣泛表達于心、腦、肝、脾、腎、骨髓等組織，其中心、肝、腎三組織的表達尤其豐富，而所檢測的細胞株中也都有豐富的表達。隨后利用酵母雙雜交實驗、pull-down實驗、免疫共沉淀實驗、細胞內(nèi)定位實驗從不同角度證明了Mpl同Atp5d蛋白在細胞內(nèi)存在相互作用。最后構(gòu)建了一系列的Mpl缺失突變體和點突變體，利用酵母雙雜交實驗確定了Atp5d蛋白結(jié)合于TPO受體胞內(nèi)區(qū)第98-113氨基酸殘基區(qū)