FK506結(jié)合蛋白3與胞內(nèi)氯離子通道蛋白1相互作用的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建FKBP3蛋白的酵母表達(dá)載體、帶不同標(biāo)簽的FKBP3蛋白和CLIC1蛋白的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體,研究FKBP3蛋白和CLIC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況和相互作用情況。
　　方法：以pGBKT7-FKBP3為模板,用PCR方法擴(kuò)增出含不同結(jié)構(gòu)域的FKBP3DNA序列,回收目的片段,回收片段插入pGBKT7載體中,構(gòu)建酵母表達(dá)載體。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送測序公司測序。用PCR的方法擴(kuò)增FKBP3和CLIC1蛋白全長序列,

2、回收目的片段,回收片段插入到帶FLAG標(biāo)簽的pcDNA3.1載體和GFP載體中,構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-FKBP3-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-CLIC1、pcDNA3.1-CLIC1-FLAG、pCD-GFP-FKBP3,分別瞬時轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察其在細(xì)胞的定位,再將帶不同標(biāo)簽的FKBP3和CLIC1蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察各組共定位情況;將pcDNA3.1-FKBP3-F

3、LAG和pCD-GFP-CLIC1共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,提取細(xì)胞裂解液,進(jìn)行免疫共沉淀,后通過westernblot檢測在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)CLIC1蛋白與FKBP3蛋白的相互作用。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切和測序鑒定,各重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。免疫熒光顯微鏡觀察實驗觀察到FKBP3蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,核膜上也有一定的集中分布。CLIC1蛋白則在帶有GFP標(biāo)簽時主要分布在細(xì)胞核,而在帶有FLAG標(biāo)簽時,無論標(biāo)簽在上游或者下游,在細(xì)胞質(zhì)