氯離子通道蛋白CLICs及其突變體與Sedlin相互作用的初步研究.pdf

1、目的：為了研究胞內(nèi)氯離子通道蛋白 CLICs及其突變體與遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin的相互作用，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建下游為FLAG標(biāo)簽的CLICs及其突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，免疫印跡和 GST pulldown實(shí)驗(yàn)等研究蛋白質(zhì)的共定位及相互作用情況，探索CLIC家族的生物學(xué)功能。
　　方法：以 pcDNA3-CLIC1-FLAG重組質(zhì)粒為模板，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-C

2、LIC1(C24A)-FLAG、 pcDNA3-CLIC1(C59A)-FLAG、pcDNA3-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG、pcDNA3-CLIC1(△49-51)-FLAG；以 CLIC2全長(zhǎng) cDNA序列為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-CLIC2-FLAG、pcDNA3-CLIC2(C30A)-FLAG；以pcDNA3-CLIC3-FLAG重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-CLIC3(C22A)-

3、FLAG；以 pcDNA3-CLIC4-FLAG重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-CLIC4(C35A)-FLAG；以CLIC5全長(zhǎng)cDNA序列為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-CLIC5(C32A)-FLAG。將真核表達(dá)質(zhì)粒單轉(zhuǎn)染入 COS7細(xì)胞，觀察其細(xì)胞定位，再將 CLICs及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒與pCDGFP-Sedlin共同轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況；將CLI

4、Cs全長(zhǎng)及其突變體轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，提取細(xì)胞總蛋白，利用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況；pGEX-5X-3-SEDL轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，制備融合蛋白，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染CLICs全長(zhǎng)及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)GST pulldown技術(shù)檢測(cè)其在體外相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)相關(guān)的重組質(zhì)粒及突變體；Western blotting結(jié)果顯示CLIC1及

5、其三個(gè)點(diǎn)突變體蛋白在HEK293T細(xì)胞中均能表達(dá)，CLIC2、CLIC3及CLIC4同樣均能表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，CLIC1主要定位在細(xì)胞核，胞質(zhì)也有表達(dá)；CLIC1點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，細(xì)胞核中無(wú)分布；CLIC1缺失突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，核有少量表達(dá)；CLIC2在細(xì)胞核及胞質(zhì)均有定位；CLIC2點(diǎn)突變體蛋白定位發(fā)生明顯變化，有少量熒光且呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布；CLIC3、CLIC4主要定位在胞質(zhì)中，細(xì)胞核有少量分布；CLIC5蛋白定位在

6、胞質(zhì)中，細(xì)胞核中無(wú)分布；CLIC3點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，核有少量表達(dá)；CLIC4點(diǎn)突變體蛋白定位在胞質(zhì)中，細(xì)胞核有少量分布；CLIC5點(diǎn)突變體蛋白主要定位在胞質(zhì)中，細(xì)胞核無(wú)分布；CLIC1、CLIC2與Sedlin蛋白在胞質(zhì)、胞核均有共定位；CLIC1點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白只在胞質(zhì)存在共定位；CLIC2點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白不存在共定位；CLIC3與Sedlin蛋白在胞質(zhì)存在共定位；CLIC3點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白在胞質(zhì)

7、存在共定位。GST pulldown實(shí)驗(yàn)表明野生型CLICs蛋白都和Sedlin蛋白存在相互作用，證明CLIC1點(diǎn)突變體與GST-Sedlin蛋白之間沒(méi)有互作關(guān)系。
　　結(jié)論： CLIC1及其點(diǎn)突變體、CLIC2、CLIC3及其點(diǎn)突變體與Sedlin蛋白均存在共定位；CLIC1及其三種點(diǎn)突變體，CLIC(2-4)均能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效表達(dá)并且野生型CLIC(1-5)都和Sedlin蛋白存在相互作用，但CLIC1點(diǎn)突變體與后者不存