Sedlin與Depp相互作用的初步研究.pdf

1、目的:利用酵母雙雜交技術(shù)了解Sedlin/Depp之間的相互作用及Sedlin與Depp相互作用的區(qū)域。構(gòu)建帶GFP標(biāo)簽的DEPP的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，觀察其在細(xì)胞內(nèi)的定位，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。 方法:以pOFF-SEDL為模板，用PCR方法擴(kuò)增SEDL-N序列，通過限制性內(nèi)切酶酶切、回收目的片段、連接等方法將SEDL-N片段插入載體pAS2-1中，構(gòu)建pAS-SEDL的缺失突變體 pAS-SEDL-N。將pA

2、CT2/pAS-SEDL、pACT2-DEPP/pAS-SEDL、pACT2/pAS-SEDL-N、pACT2-DEPP/pAS-SEDL-N四組質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化入酵母菌Y190，再通過濾膜印跡實(shí)驗(yàn)測定β-半乳糖苷酶活性，呈藍(lán)色的克隆是兩種蛋白可能相互作用的陽性克隆。 以含人DEPP全長cDNA序列的質(zhì)粒pACT2-DEPP為模板，用PCR方法擴(kuò)增DEPP全長序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接，構(gòu)建克隆載體pUCm-T-DEPP。用限制

3、性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒，回收目的片段DEPP，插入帶GFP標(biāo)簽的載體pCDGFP中構(gòu)建表達(dá)載體pCDGFP-DEPP。用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析及DNA序列分析兩種方法鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒。將構(gòu)建正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞定位。 結(jié)果:營養(yǎng)篩選和β-半乳糖苷酶活性測試均表明四組共轉(zhuǎn)化入Y190的質(zhì)粒中，僅pACT2-DEPP/pAS-SEDL組克隆為陽性，其余三組均為陰性；經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖