遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良病蛋白Sedlin與PAM14蛋白的相互作用.pdf

1、遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良?。⊿pondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT，MIM 313400）是一種X連鎖隱性遺傳病，主要累及脊椎椎體和承重大關節(jié)。其主要臨床特征為：患者骨骼病變，?；脊顷P節(jié)炎，身高增長下降致短軀干性侏儒。
　　 SEDL基因的突變導致SEDT的發(fā)生（MIM 300202）。該基因定位于Xp22，全長20 kb，包含6個外顯子。SEDL基因的表達產物為140個氨基酸組成的Sedl

2、in蛋白，而且該蛋白高度保守，在人類和酵母具有相同的氨基酸序列。Sedlin蛋白是酵母TRAPP（transport protein particle）復合物中Trs20p亞基的同源物。目前認為TRAPPⅠ定位于高爾基復合體的順面，為COPⅡ膜泡的受體，在從內質網到高爾基復合體的膜泡運輸中發(fā)揮作用；TRAPPⅡ則主要作用于高爾基復合體內部的物質運輸。酵母中Trs20p亞基是 TRAPPⅠ、TRAPPⅡ所共有的，而且Trs20p亞基的失活

3、具有致死效應，因此推測Sedlin蛋白質可能在物質運輸過程即內質網-高爾基復合體之間的膜泡運輸中發(fā)揮作用。
　　 為了了解哺乳動物細胞中Sedlin蛋白的功能，本課題組成員已經利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了若干Sedlin蛋白的結合蛋白，其中包括一些已知蛋白，如胞內氯離子通道蛋白（chloride intracellular channel，CLIC），EB病毒誘導的基因3（Epstein-Barr virus-induced ge

4、ne 3，EBI3）蛋白，MRG相關的蛋白PAM14（protein associated with MRG，14 kD），它們在細胞內均具有廣泛的功能。
　　 先前已利用細胞生物學和分子生物學手段證實了在哺乳動物細胞內Sedlin蛋白與CLIC1是相互作用的，提示Sedlin蛋白可能在細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究是在上述研究的基礎上，探尋Sedlin蛋白在哺乳動物細胞內與PAM14蛋白是否存在相互作用，以進一

5、步了解Sedlin蛋白的功能。首先構建真核表達重組質粒pCDGFP-SEDL、pCDGFP-PAM14，轉染COS7細胞，通過免疫熒光方法，檢測Sedlin蛋白、PAM14蛋白單獨表達時在細胞內的定位情況；轉染HEK 293T細胞，細胞裂解液進行Western blot鑒定蛋白質在哺乳動物細胞內的表達；構建重組質粒pGEX-3X-SEDL以表達融合蛋白GST-Sedlin，進行GST-pull down 實驗，檢測Sedlin蛋白在體外

6、與PAM14蛋白能否相互作用；進行免疫共沉淀和免疫熒光實驗，檢測在哺乳動物細胞內Sedlin蛋白與PAM14蛋白能否相互作用，能否共定位，共轉染對蛋白質的定位有無影響。
　　 實驗結果表明，Sedlin蛋白為一分子量約16kD的蛋白質，在胞質和胞核中均有分布，且主要表達于胞核；GFP-PAM14融合蛋白的分子量約為41kD，主要表達于細胞核，細胞質較少。GST-pull down 實驗結果表明，融合蛋白GST-Sedlin與PA

7、M14蛋白之間存在相互作用；免疫共沉淀實驗結果表明，在哺乳動物細胞內，Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用；免疫熒光實驗表明Sedlin蛋白與PAM14蛋白在細胞核存在共定位，且改變不同的蛋白標簽，對共定位結果沒有影響。綜上，在哺乳動物細胞內，Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用。
　　 PAM14，是由127個氨基酸殘基組成的14 kD的高度保守的蛋白質。因其與MRG15（mortality facto