Depp蛋白與Sedlin蛋白的相互作用及SEDL基因突變致遲發(fā)性骨骺發(fā)育不良機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)研究Depp蛋白與Sedlin蛋白的相互作用區(qū)域;構(gòu)建Depp蛋白及Depp蛋白N端C端缺失突變體和Sedlin蛋白的真核表達(dá)載體,共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,分別觀察在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共定位情況;構(gòu)建Sedlin蛋白四個(gè)點(diǎn)突變體D47Y,S73L,F83S,V130D到pcDGFP真核載體中轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中觀察單轉(zhuǎn)定位情況與野生型的差別,分別再與帶Flag標(biāo)簽的Depp蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞觀察共定位情況。

2、構(gòu)建帶GFP標(biāo)簽的Depp蛋白與帶Flag標(biāo)簽的Sedlin蛋白共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,進(jìn)行免疫共沉淀,檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Depp蛋白與Sedlin蛋白能否相互作用。
　　方法：以pACT2-Depp為模板,PCR擴(kuò)增Depp蛋白N端300bp和C端339bp的DNA片段,分別將片段插入到pGADT7載體中,構(gòu)建Depp缺失突變體pGADT7-Depp-N300和pGADT7-Depp-C339。將兩種缺失突變體分別與pG

3、BKT7-SEDL共同轉(zhuǎn)化酵母菌AH109感受態(tài)細(xì)胞,SD培養(yǎng)基(﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT)/X-α-gal上生長(zhǎng)篩選藍(lán)色,呈藍(lán)色的克隆是X-α-gal活性為陽(yáng)性克隆;以pGBKT7-SEDL為模板,用定點(diǎn)突變的方法分別擴(kuò)增出BD-SEDL-D47Y,S73L,F83S,V130D。分別與pGADT7-Depp共同轉(zhuǎn)化酵母菌AH109感受態(tài)細(xì)胞,篩選藍(lán)色克隆。
　　以pGBKT7-SEDL為模板,PCR擴(kuò)增Sedl

4、in蛋白全長(zhǎng)編碼序列,目的片段經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后回收,回收片段插入到帶GFP標(biāo)簽的載體中,構(gòu)建表達(dá)載體pcDGFP-SEDL及四個(gè)點(diǎn)突變體,后轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察其在細(xì)胞的定位與野生型的差別,再分別與帶Flag標(biāo)簽的Depp蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察共定位情況;PCR擴(kuò)增Sedlin編碼序列,擴(kuò)增產(chǎn)物插入到帶Flag標(biāo)簽的pCDNA3.1載體中,構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA-FLAG-SE

5、DL。通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定后,將質(zhì)粒pCDGFP-Depp和pCDNA-FLAG-SEDL共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光的方法觀察Depp蛋白和Sedlin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況;共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,提取細(xì)胞裂解液,進(jìn)行免疫共沉淀,后通過(guò)Westernblot檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Depp蛋白與Sedlin蛋白能否結(jié)合。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,各重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)篩選及α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定標(biāo)明Dep

6、p蛋白的N端和C端都能和Sedlin蛋白相互作用,Sedlin蛋白點(diǎn)突變體只有D47Y呈陽(yáng)性,其他三個(gè)點(diǎn)突變是陰性;免疫熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)觀察到Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中共同集中分布于細(xì)胞核周區(qū)域,且N端共定位和野生型相似;Sedlin蛋白的四個(gè)點(diǎn)突變體和Flag-Depp蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,表明GFP-SEDL-D47Y共定位和野生型分別相似,在核周核內(nèi)都有分布,而S73L,F83S,V130D主要共定位

7、于核周。Westernblot檢測(cè)顯示Depp蛋白和N端均表達(dá),而C端未見(jiàn)表達(dá);免疫共沉淀和Westernblot檢測(cè)證明Depp蛋白和Sedlin蛋白能在HEK293T細(xì)胞中相互結(jié)合。
　　結(jié)論：Depp蛋白與Sedlin蛋白相互作用關(guān)鍵區(qū)域位于其N端300bp編碼100個(gè)氨基酸的片段內(nèi);免疫熒光實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Depp蛋白和Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中集中共定位于細(xì)胞核周圍區(qū)域,提示Depp蛋白和Sedlin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用