GTFⅡF2突變體與CLIC1蛋白的相互作用.pdf

1、目的：本文旨在研究證明GTFⅡF2突變體是否與CLIC1蛋白之間存在相互作用及GTFⅡF2的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖及遷移的影響，分別應(yīng)用了質(zhì)粒構(gòu)建、酵母雙雜交、間接免疫熒光、免疫印跡、GST pulldown、免疫共沉淀以及RNA干擾等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、食管癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞加以證實(shí)，為探索GTFⅡF2的功能及其突變體和CLIC1蛋白功能的關(guān)系奠定一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)GTFIIF2

2、突變體的上下游引物，利用PCR方法分別擴(kuò)增缺失突變體GTFⅡF2-N：GTFⅡF2-（1-165 aa）；GTFⅡF2（1-100 aa）；GTFⅡF2（1-142 aa）和GTFⅡF2-C：GTFⅡF2（161-249 aa）；GTFⅡF2（101-249 aa）；GTFⅡF2（143-249 aa），將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測(cè)序。在內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，分別利用GTFⅡF2和CLIC1抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后

3、，收集瓊脂糖珠珠子western blot分析GTFⅡF2與CLIC1蛋白之間是否相互影響。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建GTFⅡF2突變體的酵母表達(dá)質(zhì)粒pGΑDT7-GTFⅡF2（1-165 aa），pGΑDT7-GTFⅡF2（161-249 aa），pGBKT7-GTFⅡF2（1-165 aa），pGBKT7-GTFⅡF2（161-249 aa），分別與實(shí)驗(yàn)室保存的pGBKT7-CLIC1，pGΑDT7-CLIC1共同轉(zhuǎn)化于酵母感受態(tài)細(xì)胞Α

4、H109中，并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)篩選，對(duì)長(zhǎng)出的酵母克隆使用X-α-gαl進(jìn)行活性測(cè)定，通過顏色篩選克隆是否變藍(lán)來證明GTFⅡF2（1-165 aa），GTFⅡF2（161-249 aa）是否與CLIC1存在相互作用。構(gòu)建GTFⅡF2各個(gè)突變體于pcDNA3.1和pCDGFP真核表達(dá)載體上，在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，分別將pcDNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pcDGFP-GTFⅡF2突變體或者FLΑ

5、G-GTFⅡF2突變體和pcDGFP-CLIC1共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS7中，進(jìn)行免疫熒光制片，通過激光共聚焦觀察GTFⅡF2突變體是否與CLIC1存在共定位現(xiàn)象。在外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，分別將pcDNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pcDGFP-GTFⅡF2突變體共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T中，利用FLAG抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后，收集瓊脂糖珠珠子western blot分析。在GST pulldown中，分別將GFP標(biāo)

6、簽的相關(guān)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T中與實(shí)驗(yàn)室保存的GST-CLIC1或者GST-GTFⅡF2突變體融合蛋白在體外混旋，收集谷胱甘肽珠子進(jìn)行western blot分析GTFⅡF2突變體是否與CLIC1存在相互作用。人工合成靶向GTFⅡF2基因的siRNA序列和陰性對(duì)照siRNA序列及質(zhì)粒pcDNA3.1-GTFⅡF2-FLAG，分別轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞中，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

7、>　　結(jié)果：限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果和測(cè)序結(jié)果一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用GTFⅡF2抗體免疫印跡后，能夠檢測(cè)CLIC1蛋白的存在，當(dāng)用CLIC1抗體免疫印跡后，同樣能夠檢測(cè)GTFⅡF2蛋白的存在，說明二者存在相互作用。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，分別表達(dá)了野生型GTFⅡF2與CLIC1和缺失突變體GTFⅡF2（1-165）與CLIC1蛋白的酵母細(xì)胞能夠在 SD3-培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，并且酵母克隆在進(jìn)行α-

8、半乳糖苷酶活性測(cè)定后顏色變藍(lán)，證明二者存在相互作用；共同表達(dá)了GTFⅡF2（161-249）和CLIC1兩種蛋白的酵母細(xì)胞在 SD3-培養(yǎng)基中不能夠正常生長(zhǎng)并且進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性測(cè)定后顏色沒有變化，說明二者不存在相互作用。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)LAG-GTFⅡF2突變體與CLIC1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，二者在細(xì)胞質(zhì)中的相同部位都有表達(dá)。GFP-GTFⅡF2-N在COS7細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞質(zhì)，與CLIC1蛋白無明顯定位，而G

9、FP-GTFⅡF2-C細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布，與CLIC1蛋白有明顯的共定位。外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)用GFP抗體免疫印跡后，實(shí)驗(yàn)組GFP-GTFⅡF2突變體和CLIC1-FLΑG中能夠檢測(cè)到GFP-GTFⅡF2-N的存在，表明FLAG抗體在沉淀CLIC1-FLΑG的同時(shí)也將GFP-GTFⅡF2-N共同沉淀下來，即證明二者存在相互作用，并且相互作用的結(jié)構(gòu)域在（1-100 aa）。GST pulldown實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組GFP-CLI

10、C1+GST-GTFⅡF2-N能夠檢測(cè)到 GTFⅡF2-N的存在，表明GST-GTFⅡF2-N非GST-GTFⅡF2-C融合蛋白在體外條件下能夠下拉GFP-CLIC1；實(shí)驗(yàn)組 GST-CLIC1+GFP-GTFⅡF2突變體能夠檢測(cè)到 GTFⅡF2-N的存在，表明GST-CLIC1融合蛋白在體外條件下能夠下拉 GTFⅡF2-N，則初步證明 GTFⅡF2蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用的結(jié)構(gòu)域在（1-100 aa）。RNA干擾技術(shù)靶向沉默G

11、TFⅡF2基因表達(dá)后，食管癌細(xì)胞的增殖和遷移均明顯受到了抑制，而過表達(dá)GTFⅡF2對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移沒有明顯的影響。
　　結(jié)論：內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)在GTFⅡF2與CLIC1相互作用，并且通過酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pulldown、間接免疫熒光等四種實(shí)驗(yàn)技術(shù)充分證明了GTFⅡF2-N和CLIC1蛋白在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都存在相互作用，而且相互作用的結(jié)構(gòu)域是在N端前100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。Knockdown GTFⅡ