RACK1缺失突變體與氯離子通道蛋白1(CLIC1)相互作用的研究.pdf

1、目的：為了研究RACK1缺失突變體與氯離子通道蛋白CLIC1的相互作用，運(yùn)用分子克隆技術(shù)將活化蛋白激酶C受體1（RACK1）缺失突變體構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒中，研究RACK1缺失突變體在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位及其與CLIC1蛋白的相互作用。
　　方法：以 pcDNA3.1-RACK1-FLAG為模板，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、 pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pcD

2、NA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、 pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG；瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。Western blot法檢測(cè)其在 HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)；運(yùn)用免疫熒光技術(shù)了解RACK1缺失突變體在COS7細(xì)胞中的定位情況以及與CLIC1蛋白的共定位情況。免疫共沉淀法進(jìn)一步探究RACK1缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白的

3、相互作用情況，內(nèi)源性RACK1蛋白CLIC1蛋白的相互作用。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了RACK1缺失突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒；Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG外其余突變體在HEK293T細(xì)胞的裂解液中均有表達(dá)；pcDNA3.1-RACK1(1-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、 pc

4、DNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG在HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞沉淀中均有表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，RACK1缺失突變體在COS7細(xì)胞中主要定位在胞質(zhì)，細(xì)胞核中也有少量定位，與CLIC1蛋白均存在部分共定位。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)源性的 RACK1蛋白與 CLIC1蛋白存在相互作用，缺失突變體pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、 pcDNA3.1-

5、RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了RACK1缺失突變體真核表達(dá)質(zhì)粒，并在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明五個(gè)RACK1缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白都存在部分共定位；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，缺失突變體及內(nèi)源性 RACK1蛋白與CLIC1蛋白在體