RACK1缺失突變體與氯離子通道蛋白1(CLIC1)相互作用的研究.pdf

1、目的：為了研究RACK1缺失突變體與氯離子通道蛋白CLIC1的相互作用，運用分子克隆技術(shù)將活化蛋白激酶C受體1（RACK1）缺失突變體構(gòu)建到真核表達質(zhì)粒中，研究RACK1缺失突變體在真核細胞內(nèi)的表達、定位及其與CLIC1蛋白的相互作用。
　　方法：以 pcDNA3.1-RACK1-FLAG為模板，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、 pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pcD

2、NA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、 pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG；瓊脂糖凝膠電泳法檢測重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。Western blot法檢測其在 HEK293T細胞中的表達；運用免疫熒光技術(shù)了解RACK1缺失突變體在COS7細胞中的定位情況以及與CLIC1蛋白的共定位情況。免疫共沉淀法進一步探究RACK1缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白的

3、相互作用情況，內(nèi)源性RACK1蛋白CLIC1蛋白的相互作用。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了RACK1缺失突變體的真核表達質(zhì)粒；Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)除pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG外其余突變體在HEK293T細胞的裂解液中均有表達；pcDNA3.1-RACK1(1-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、 pc

4、DNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG在HEK293T細胞的細胞沉淀中均有表達；免疫熒光實驗表明，RACK1缺失突變體在COS7細胞中主要定位在胞質(zhì)，細胞核中也有少量定位，與CLIC1蛋白均存在部分共定位。免疫共沉淀實驗證明，內(nèi)源性的 RACK1蛋白與 CLIC1蛋白存在相互作用，缺失突變體pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、 pcDNA3.1-

5、RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了RACK1缺失突變體真核表達質(zhì)粒，并在HEK293T細胞中成功表達；免疫熒光實驗表明五個RACK1缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白都存在部分共定位；免疫共沉淀實驗進一步顯示，缺失突變體及內(nèi)源性 RACK1蛋白與CLIC1蛋白在體