FKBP25及其突變體與CLIC1蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)相互作用及功能的研究.pdf

1、目的：本課題旨在研究 FK506結(jié)合蛋白25（ FKBP25）野生型及其突變體FKBP25(1-42 aa)、FKBP25(1-110 aa)、FKBP25(43-224 aa)、FKBP25(43-110 aa)、FKBP25(111-224 aa)在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位以及和胞內(nèi)氯離子通道蛋白1（CLIC1）的相互作用。
　　方法：以 pcDNA3.1-FKBP25-FLAG為模板，利用 PCR技術(shù)，分別擴(kuò)增出目的片段：FK

2、BP25野生型及其缺失突變體 FKBP25(1-42 aa)、FKBP25(1-110 aa)、FKBP25(43-224 aa)、FKBP25(43-110 aa)、FKBP25(111-224 aa)，經(jīng)過(guò)12％DNA凝膠電泳、酶切、膠回收目的片段后，將目的片段構(gòu)建至 pcDNA3.1(+)載體 FLAG標(biāo)簽、pcDNA3.1(+)載體 HA標(biāo)簽、pCDGFP載體、pGEX-5X-3載體、pGADT7載體、pGBKT7載體上。分別用

3、相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，挑選一管酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送至安徽通用生物系統(tǒng)有限公司測(cè)序。分別將 FKBP25野生型及突變體 FKBP25(1-42 aa)、FKBP25(1-110 aa)、FKBP25(43-224 aa)、FKBP25(43-110 aa)、FKBP25(111-224 aa)和 CLIC1的酵母表達(dá)載體質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化至酵母菌 AH109中，在 SD/-Leu/-Trp/-His/3-AT/X-α-

4、gal固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，利用酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè) FKBP25與CLIC1蛋白在酵母細(xì)胞中相互作用的情況，用以確定二者相互作用的最小結(jié)構(gòu)區(qū)域；分別將 pcDNA3.1載體 FLAG標(biāo)簽、pcDNA3.1載體 HA標(biāo)簽、pCDGFP載體的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 HEK293T細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況；將上述質(zhì)粒分別與 CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 COS7細(xì)胞，在激光共聚掃描焦顯微鏡下觀察、分析熒光共定位情況。將帶有

5、pCDGFP標(biāo)簽的 CLIC1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 HEK293T細(xì)胞中，同時(shí)制備 FKBP25野生型及突變體的 GST融合蛋白，使用 GST pulldown技術(shù)檢測(cè) FKBP25及其缺失突變體蛋白與 CLIC1蛋白在體外相互作用的情況。將上述真核表達(dá)質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 HEK293T細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)（co-IP）檢測(cè) FKBP25野生型及其缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的相互作用。
　　結(jié)果：經(jīng)雙酶切和測(cè)序結(jié)果

6、鑒定，pcDNA3.1載體 FLAG標(biāo)簽、pcDNA3.1載體 HA標(biāo)簽、pCDGFP載體、pGEX-5X-3載體、pGADT7載體、pGBKT7載體等一系列重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western blot顯示：pCDGFP-FKBP25及其突變體 pCDGFP-FKBP25(1-42 aa)、pCDGFP-FKBP25(43-224 aa)、pCDGFP-FKBP25(111-224 aa)、pCDGFP-FKBP25(1-110 aa)、

7、pCDGFP-FKBP25(43-110 aa)均能在HEK293T細(xì)胞中有效表達(dá)；在免疫熒光共聚焦顯微鏡下觀察，在 COS7細(xì)胞中GFP-FKBP25野生型主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中表達(dá)較少，而突變體在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有表達(dá)，而且細(xì)胞核中的表達(dá)多于野生型；共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：野生型 FKBP25蛋白與 CLIC1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在明顯的共定位；其三個(gè)缺失突變體與 CLIC1蛋白的共定位明顯減少，而且共定位也存在區(qū)別：FKBP25(1

8、-42 aa)與 CLIC1共定位主要于細(xì)胞核，部分于細(xì)胞質(zhì)中；FKBP25(43-224 aa)和FKBP25(111-224 aa)與 CLIC1共定位于細(xì)胞質(zhì)中。GST pulldown實(shí)驗(yàn)表明，在體外條件下， FKBP25蛋白及缺失突變體 FKBP25(43-224 aa)和 FKBP25(111-224 aa)與 CLIC1蛋白存在相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到內(nèi)源性FKBP25與 CLIC1蛋白在 HEK293T細(xì)胞中也存在

9、相互作用。
　　結(jié)論： FKBP25野生型及其3種突變體 FKBP25(1-42 aa)、FKBP25(43-224 aa)、FKBP25(111-224 aa)與 CLIC1蛋白存在不同程度的共定位現(xiàn)象，GST pulldown實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，F(xiàn)KBP25及缺失突變體 FKBP25(43-224 aa)和 FKBP25(111-224 aa)蛋白與 CLIC1蛋白存在相互作用，內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FKBP25與 CL