水稻氯離子通道蛋白基因OsCLC的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、在得到公認(rèn)的、7種植物所必需的微量元素中，Cl元素雖然是最晚被發(fā)現(xiàn)的，但對植物正常的生長和發(fā)育過程起著舉足輕重的作用。目前，氯離子通道(Chloride Charmel，CLC)一般被認(rèn)為與滲透調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動、營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、金屬耐性、信號識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多功能有關(guān)。關(guān)于植物氯離子通道蛋白全序列克隆和功能的研究開展起步較哺乳動物晚，而且多在擬南芥、煙草等雙子葉植物中進(jìn)行。水稻作為單子葉植物的代表植物和最重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物之一，關(guān)于氯離子通道

2、的研究報道并不多見。 本研究在水稻全基因組測序基本完成的前提和基礎(chǔ)上，利用抑制消減雜交法(SSH)建立的水稻分化愈傷組織對愈傷組織的差減文庫，針對特異性表達(dá)的EST序列進(jìn)行分析和設(shè)計(jì)，首次從粳稻品種武進(jìn)9998-3中分離到一個氯離子通道蛋白編碼全長基因OsCLC，并對其表達(dá)譜和功能進(jìn)行了初步的研究，其主要結(jié)果如下： 1)以粳稻品種武進(jìn)9998-3為材料，擴(kuò)增出一個2429bp的全長cDNA序列 OsCLC(登錄號：DQ2

3、72692)。該序列具有完整的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼808個氨基酸，結(jié)構(gòu)預(yù)測表明OsCLC具有11個疏水跨膜區(qū)、1個電壓門控的氯離子通道結(jié)構(gòu)(Voltage CLC)、1個胱硫醚β-合酶(Cystathionine-beta-synthase，CBS)結(jié)構(gòu)域和3個與陰離子選擇性有關(guān)的高度保守區(qū)(GSGIPE、GKAGPLVH和PVGGVLF)；與煙草CLC-Ntl、擬南芥AtCLC-a、AtCL

4、C-b、AtCLC-c、AtCLC-d和水稻日本晴OsCLC-1、OsCLC-2相似程度分別達(dá)到59％、54％、52％、58％、47％、63％和63％； 2)用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將OsCLC基因?qū)脶劸平湍竼我坏穆入x子通道基因ScCLC(Gefl)缺失的突變菌株中進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，可使其在添加有NaCl的培養(yǎng)基上生長功能得到部分恢復(fù)，且互補(bǔ)程度在高鹽濃度下更加明顯；同時在培養(yǎng)基中添加CaCl<,2>、KCl、MgCl<,2>(Cl<'

5、->濃度為500 mmol/L)的結(jié)果顯示：不同類型的陽離子對OsCLC的互補(bǔ)作用無影響；這些結(jié)果提示我們OsCLC基因可能在細(xì)胞內(nèi)起到平衡質(zhì)子電荷的作用。 3)實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)SYBR Green I熒光染料法檢測OsCLC基因表達(dá)譜分析表明： a)該基因在水稻的幼穗、旗葉、葉鞘、根、節(jié)、節(jié)間、葉、愈傷、芽點(diǎn)等組織中均有表達(dá)，根中的表達(dá)量最高；與日本晴的OsCLC-1表達(dá)情況類似，屬于非

6、組織特異性表達(dá)基因。 B)在0、50、100、200 mmol/LNaCl脅迫下，其表達(dá)量與鹽濃度、脅迫時間相關(guān)：鹽脅迫環(huán)境下生長1hr后，200 mmol/L NaCl脅迫下的表達(dá)量陡升至2.70倍，0、50、100 mmol/LNaCl基本無變化；8hr后50、100 mmol/L NaCl脅迫下的表達(dá)量分別達(dá)到2.74倍和3.16倍，同時200 mmol/LNaCl脅迫下的表達(dá)量卻已降低至1.52倍；16hr后各濃度脅迫下