大螟氣味結合蛋白基因的克隆和功能分析.pdf

1、昆蟲在長期的進化過程中，形成了以觸角為主的極為發(fā)達的嗅覺系統(tǒng)，藉此識別環(huán)境中大量的化學信息，從而做出相應的生理和行為反應，如尋找配偶、食物源、棲息和產(chǎn)卵場所、逃避天敵等。鱗翅目昆蟲為全變態(tài)昆蟲，其中蛾類昆蟲的成蟲為夜行性，需要更為靈敏的嗅覺系統(tǒng)，以適應夜間對異性個體、寄主植物等的嗅覺定向。氣味結合蛋白(Odorantbindingprotein，OBP)是高濃度存在于昆蟲觸角感器腔內的一類水溶性小分子蛋白，具有對進入到觸角內的脂溶性氣味

2、物質進行結合并運送到感受神經(jīng)元受體部位的作用，因此被認為是昆蟲嗅覺的第一個生化步驟。大螟（Sesamiainferens）屬鱗翅目、夜蛾科，自2000年以來，大螟逐漸上升為我國重要的水稻害蟲，基于嗅覺的行為調控技術在很多害蟲的防治中已經(jīng)得到應用，深入研究OBP等嗅覺相關基因及其功能，對于開發(fā)高效的大螟行為調控技術具有重要意義。本研究利用大螟轉錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學和分子生物學相結合的方法，從大螟中克隆了3個性信息素結合蛋白(Phero

3、monebindingprotein，PBP)基因和2個一般氣味結合蛋白(Generalodorantbindingprotein，GOBP)基因，測定了它們的組織表達譜，并利用熒光競爭結合實驗初步探索了它們的生理功能。主要結果如下:
　　1、大螟OBP的基因克隆及序列分析
　　通過設計簡并引物，結合轉錄組數(shù)據(jù)分析并利用RACE技術，克隆了大螟3個PBP和2個GOBP基因的全長cDNA序列。5個基因分別命名為SinfPBP1

4、、SinfPBP2、SinfPBP3、SinfGOBP1和SinfGOBP2，3個PBP的全長cDNA序列的GenBank登錄號分別為JF927621、JN984058、JF927622、KC887506和KF150178。序列分析表明，所有OBP均具有典型OBP的序列特征，其中包括6個保守的半胱氨酸位點。SinfPBP1、SinfPBP2、SinfPBP3、SinfGOBP1和SinfGOBP2的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲，尤其是夜蛾

5、科昆蟲OBP具有很高的相似性，分別達94％、88％、85％、91％和87％。進化樹分析顯示，這5個OBP分屬于PBP和GOBP兩個亞類，不同基因間的距離與昆蟲間的親緣關系一致。
　　2、大螟OBP基因在雌雄成蟲不同組織及不同日齡觸角的表達量
　　組織表達譜分析及雌雄間差異比較是了解OBP基因功能的重要途經(jīng)。為了明確SinfOBP基因的組織分布情況，首先利用RT-PCR技術檢測了這5個基因在雌雄成蟲不同組織的表達量。結果表明，

6、5個OBP均主要觸角中表達，其他組織幾乎不表達。進一步通過qPCR技術，定量比較了5個OBP在雌雄觸角中不同日齡的表達動態(tài)及性別差異。結果發(fā)現(xiàn)，5個SinfOBP在雌雄觸角中的表達量均在4日齡達到最高值;雌雄比較而言，PBP1和PBP2在雄蟲中的表達量顯著高于雌蟲，而PBP3則在雌蟲中的表達量略高于雄蟲，以4日齡為例3個PBP表達量的雄雌比分別為11∶1、6∶1和1∶1.6。2個GOBP基因的表達量在雌雄間均無顯著差異。
　　3、

7、大螟PBP的體外表達及純化
　　為了研究PBP的嗅覺功能，進一步對這大螟3個PBP基因進行了體外大量表達和純化。首先將3個基因構建到pGEX-4T-1(PBP1、PBP2)和pET-30a(+)(PBP3)表達載體中，然后在大腸桿菌Escherichiacoli中經(jīng)IPTG誘導表達。誘導產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明，pGEX/SinfPBP1、pGEX/SinfPBP2和pET/SinfPBP3分別在約42kDa、42kDa和2

8、2kDa處有一明顯加粗條帶，和預期大小一致;3個外源表達的PBP中，PBP1和PBP2以可溶性形式存在，而PBP3以包涵體形式存在。重組蛋白經(jīng)親和層析、酶切表達標簽等步驟純化后，冷凍干燥用于后續(xù)功能分析。
　　4、大螟PBP的配體結合能力分析
　　利用熒光競爭結合實驗測定了3個SinfPBP對包括大螟性信息素及水稻揮發(fā)物在內共30種氣味物質的結合能力，發(fā)現(xiàn)SinfPBP1對3個性信息素組分Z9-16∶Ald、Z9-16∶OH

9、和Z9-16∶Ac都有很強的結合能力，Ki值分別為0.72、1.00和1.60;SinfPBP2對醇類和醛類性信息素組分及其類似物也表現(xiàn)出很強的結合能力，Ki值分別為0.78和1.71，但對酯類組分卻沒有結合能力;SinfPBP3對大螟的3種性信息素組分均無明顯結合能力。與性信息素組分相比較，3個PBP與植物揮發(fā)物的結合能力普遍較差。綜合分析認為，在大螟雄蛾對雌雄性信息素的感受中，PBP1起主要作用，PBP2具有識別醇類和醛類組分的功能