中華蜜蜂表皮蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、昆蟲的蛻皮和變態(tài)是昆蟲發(fā)育生物學研究的熱點之一。昆蟲的角質層主要由表皮蛋白和幾丁質組成;幾丁質由N-乙酰葡萄糖胺聚合而成，結構明確，而表皮蛋白的結構和特征具有多樣性，昆蟲角質層的性質主要由其中的表皮蛋白性質所決定。表皮蛋白和表皮蛋白基因被認為是研究昆蟲蛻皮與變態(tài)調控機理的重要模型，受到越來越多的重視。目前關于表皮蛋白家族基因的研究多數(shù)集中在果蠅、家蠶等物種，蜜蜂中這類基因的相關研究很少。中華蜜蜂是我國特有的優(yōu)良土著蜂種，對維護植物資源物

2、種的多樣性，促進農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。研究表皮蛋白家族基因功能可以為深入闡明分析中華蜜蜂的蛻皮發(fā)育機制，豐富中華蜜蜂資源保護理論提供科學依據(jù)。
　　本研究以中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為材料，利用同源序列，通過RT-PCR和RACE-PCR的方法克隆得到中華蜜蜂兩個表皮蛋白新基因，分別命名為AccCPR1和AccCPR2并對它們進行了生物信息學分析、表達特性分析和功能預測。本研究的具體結果如下:

3、>　　(1)從中華蜜蜂中分離得到首個R&R亞族的表皮蛋白基因，命名為AccCPR1，Genbank登陸號為JQ282798。其cDNA全長為822 nt，包括573 nt的開放閱讀框，編碼一個190個氨基酸殘基的多肽，預測的分子量和等電點分別為21.3 kDa和6.50。生物信息學分析表明，多肽鏈中包含一個幾丁質結合區(qū)域，屬于典型的R&R-2型表皮蛋白;在幾丁質結合區(qū)域β-折疊頻繁發(fā)生(42.5％)，而在其他的區(qū)域一個β-折疊也沒有;A

4、ccCPR1與同屬于膜翅目的CPRs比屬于雙翅目或半翅目的CPRs在系統(tǒng)進化關系上更親密。R&R保守基序中最保守的序列:G-x8-G-x6-Y/F，幾乎在所有的表皮蛋白(CPRs)保持不變，但AccCPR1及其直系同源物對于最保守的R&R基序的組成序列(G-x8-G-x6-Y/F)是個例外。在其啟動子序列中發(fā)現(xiàn)5個E74和4個BR-C轉錄因子結合位點，推測AccCPR1可能參與蜜蜂的蛻皮與變態(tài)。
　　實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，當蜜蜂

5、體內蛻皮激素的濃度到達高峰開始下降時AccCPR1啟動轉錄，這說明AccCPR1的轉錄需要一個蛻皮激素的“脈沖”機制。我們采用不同的試驗方法驗證了這個假設。20E是蛻皮激素的主要成分，當給幼蟲飼喂含有不同濃度的20E時，高濃度的蛻皮激素抑制了AccCPR1的表達。將白蛹期的胸部表皮在含有不同濃度的20E的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高濃度的蛻皮激素抑制AccCPR1的表達，除去20E可以恢復表達。組織特異性表達與免疫組織化學定位表明AccCPR1

6、在表皮與中腸表達。這些結果表明，AccCPR1是一種典型的R&R-2型表皮蛋白，在蜜蜂的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并且蛻皮激素的“脈沖”機制對AccCPR1的表達非常重要。
　　(2)從中華蜜蜂中分離得到第二個R&R亞族的表皮蛋白基因，并命名為AccCPR2，Genbank登陸號為KJ502287。其cDNA全長為1134 nt，編碼一個234個氨基酸殘基的多肽，預測的分子量為26.3 kDa，預測的等電點為6.69。多肽鏈中包含一個幾

7、丁質結合區(qū)域，R&R保守基序中最保守的序列:G-x8-G-x6-Y/F，可以在AccCPR2及其直系同源物的幾丁質結合區(qū)域發(fā)現(xiàn)。AccCPR2基因組的第一個內含子在編碼5個氨基酸之后中斷信號肽，而這是昆蟲表皮蛋白家族基因組序列的一個典型特征;在5'端空白區(qū)域發(fā)現(xiàn)了若干個假定的與發(fā)育有關的轉錄因子結合位點，包括3個假定的BR-C結合位點、5個假定的CdxA結合位點、1個假定的HB結合位點和3個假定的DFD結合位點，說明AccCPR2可能參

8、與蜜蜂的蛻皮與變態(tài)。
　　生物信息學分析表明AccCPR2也屬于與幾丁質結合的R&R-2類型表皮蛋白，但是其表達方式與以往在有些昆蟲上已經發(fā)現(xiàn)的“脈沖”機制有比較大的差異。不同發(fā)育時期的表達特性分析表明，在蛹期AccCPR2的表達量隨著蛻皮激素濃度的升高而增加，說明AccCPR2的轉錄需要蛻皮激素持續(xù)存在。將預蛹期的表皮在含有不同濃度的20E的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著20E濃度的升高，AccCPR2表達量增加，并進一步確定了20E誘

9、導表皮蛋白表達需要的時間。將剛出房的成年幼蜂暴露于各種應激條件中檢測發(fā)現(xiàn)，AccCPR2mRNA的表達水平在重金屬(HgCl2，CdCl2)處理后上升，而在殺蟲劑（溴氰菊酯，百草枯）處理后先上升后下降。AccCPR2基因的抗逆性直接證據(jù)來自重組蛋白的活性分析，盡管重金屬和殺蟲劑處理間基因表達的模式有所不同，但是菌落擴散試驗的結果是相似的。異源表達結果表明，AccCPR2可能參與抗逆性應激反應。
　　本研究結果發(fā)現(xiàn)，AccCPR1和