飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及功能研究.pdf

1、飛蝗是世界性農(nóng)業(yè)害蟲，在我國農(nóng)業(yè)歷史上蝗災(zāi)與水災(zāi)、旱災(zāi)一起，并稱三大自然災(zāi)害。近半個(gè)世紀(jì)以來，長期的化學(xué)防治不僅使飛蝗產(chǎn)生了抗藥性，并且化學(xué)農(nóng)藥的殘留給生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重污染。昆蟲的體壁具有十分重要的保護(hù)作用和生理功能，體壁形成相對(duì)封閉的內(nèi)環(huán)境，使得蟲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)得到外層屏障的保護(hù)，能夠起到抑制水分蒸發(fā)和抵御外界環(huán)境影響等作用。蛋白質(zhì)是昆蟲體壁的重要組成成分，其成分的缺失或含量變化都會(huì)引起表皮功能異常甚至是功能喪失，從而影響昆蟲的生長發(fā)育。

2、本文基于課題組構(gòu)建的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索得到飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因序列，對(duì)其進(jìn)行分子特性、基因表達(dá)和基于RNA干擾的功能研究。研究結(jié)果可為飛蝗防治探索新的分子靶標(biāo)，為飛蝗有效控制提供新的思路與理論依據(jù)。
　　一、飛蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的搜索、克隆及鑒定
　　基于課題組構(gòu)建的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法搜索獲得類似LmObst家族基因的cDNA片段，經(jīng)過Blast分析，得到Obst

3、家族基因的cDNA序列；設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該家族基因的全長cDNA序列；將得到的8個(gè)LmObst家族基因?qū)?yīng)的氨基酸序列分別在SignalP在線軟件和SMART網(wǎng)站進(jìn)行蛋白的信號(hào)肽和其功能域分析，發(fā)現(xiàn)均具有LmObst家族表皮蛋白的特點(diǎn)，即1個(gè)信號(hào)肽與3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD2。同時(shí)使用Mega5.10軟件中Neighbor-Joining方法，與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）Obst家

4、族基因和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）CPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)聚類分析結(jié)果，分別將上述基因命名為LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。
　　二、飛蝗Obstructor家族基因的時(shí)空表達(dá)
　　根據(jù)得到的8個(gè)飛蝗 LmObs

5、t家族基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用real-time quantitative PCR（qPCR）檢測(cè)飛蝗8個(gè)表皮蛋白基因在飛蝗5齡若蟲不同組織部位和5齡若蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果顯示飛蝗LmObsts家族基因在5齡若蟲的7個(gè)不同組織部位均有表達(dá)，其中LmObst-E1和LmObst-E2在前腸和后腸特異性高表達(dá)，LmObst-D1在體壁和前腸表達(dá)量高，其他 LmObsts在體壁或外胚層內(nèi)陷形成的前腸和后腸高表達(dá)

6、，在胃盲囊、中腸、馬氏管和脂肪體中低表達(dá)。LmObst家族基因在5齡若蟲不同天數(shù)體壁的表達(dá)趨勢(shì)較為一致，即在5齡前期高表達(dá)，中期降到最低，蛻皮前又上升到高水平。
　　三、飛蝗Obstructor家族基因的功能研究
　　根據(jù)飛蝗LmObst家族基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的特異性雙鏈引物，采用RNAi技術(shù)研究基因的生物學(xué)功能。首先于2齡若蟲第2天分別注射3μg和10μg dsRNA，24 h后取樣檢測(cè)基因沉默效率，結(jié)果

7、表明：3μg的注射劑量僅能沉默兩個(gè)基因LmObst-A1和LmObst-D2的表達(dá)，10μg dsRNA注射沉默了5個(gè)基因的表達(dá)，但仍然有3個(gè)基因LmObst-A2、LmObst-B和LmObst-C的表達(dá)未實(shí)現(xiàn)有效沉默。之后根據(jù)5齡若蟲不同天數(shù)的表達(dá)圖譜，選擇表達(dá)量較低的時(shí)間點(diǎn)即5齡若蟲第5天分別注射10μg dsRNA，在表達(dá)量較高時(shí)即48 h后檢測(cè)沉默效率，發(fā)現(xiàn)目的基因表達(dá)量顯著降低，全部基因得以成功沉默。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，注射ds

8、LmObst-E1的5齡若蟲80％無蛻皮跡象，在5齡若蟲狀態(tài)下死亡，剩余20%若蟲蛻皮延遲1 d，并且在蛻至成蟲后很快死亡；其余注射雙鏈的試蟲普遍發(fā)生蛻皮延遲1-3d的現(xiàn)象，但尚未發(fā)現(xiàn)其他可見的異常表型。
　　綜上所述，本文獲得飛蝗8個(gè)表皮蛋白LmObst家族基因，所有LmObst家族蛋白均有1個(gè)信號(hào)肽與3個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域 ChtBD2，功能域保守；時(shí)空表達(dá)圖譜顯示LmObsts基因可能參與飛蝗體壁和前后腸等外胚層發(fā)育來源組織器官的