飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因克隆及特性研究.pdf

1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)廣泛存在，在化學(xué)殺蟲(chóng)劑的解毒代謝過(guò)程中發(fā)揮主要的作用。飛蝗是主要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)為害較大。近年來(lái)，隨著氣候的變化及生態(tài)環(huán)境的破壞，蝗蟲(chóng)為害日益嚴(yán)重，并且隨著化學(xué)殺蟲(chóng)劑的濫用導(dǎo)致蝗蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性降低。為了能更有效地治理蝗蟲(chóng)，本文以飛蝗為材料，對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶在分子和蛋白水平進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要內(nèi)容如下:
　　一、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因克隆
　　從飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得10個(gè)飛蝗

2、GSTs序列片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)BLASTX比對(duì)確認(rèn)，通過(guò)RACE-PCR技術(shù)獲得10個(gè)飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析9個(gè)GSTs屬于三個(gè)家族細(xì)胞質(zhì)GSTs，其中1個(gè)屬于delta家族(LmGSTd1)，7個(gè)屬于sigma家族(LmGSTs1，LmGSTs2，LmGSTs3，LmGSTs4，LmGSTs5，LmGSTs6和LmGSTs7)，1個(gè)屬于theta家族（LmGSTt1）。剩余的

3、1個(gè)GST與已知家族昆蟲(chóng)GSTs有較低的相關(guān)性，歸為unclassified家族(LmGSTu1)。
　　二、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因分子特性研究
　　采用RT-PCR方法，檢測(cè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因在飛蝗卵、1齡到成蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LmGSTs2，LmGSTs4，LmGSTs6和LmGSTs7四個(gè)基因在卵階段mRNA的表達(dá)量較低，LmGSTu1在卵期未見(jiàn)表達(dá)。LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs3，

4、LmGSTs5和LmGSTt1在飛蝗各個(gè)發(fā)育階段表達(dá)情況沒(méi)有明顯變化。采用RT-PCR方法，檢測(cè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因在飛蝗前腸、中腸、胃盲囊、后腸、馬氏管、脂肪體、肌肉、精巢和卵巢9個(gè)不同組織部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs3，LmGSTs5，LmGSTs6和LmGSTt16個(gè)基因在所有組織中都表達(dá)。LmGSTs2，LmGSTs4，LmGSTs7和LmGSTu1在部分組織部位表達(dá)。Real-time

5、PCR研究發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯濃度在0.08μg/mL與0.12μg/mL時(shí)，飛蝗3齡蝗蝻的10個(gè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因mRNA表達(dá)量增加。然而當(dāng)溴氰菊酯濃度在0.16μg/mL或0.2μg/mL時(shí)LmGSTd1，LmGSTs1，LmGSTs5和LmGSTs6的mRNA表達(dá)量降低。溴氰菊酯處理后飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因mRNA表達(dá)量增加，可能會(huì)導(dǎo)致飛蝗對(duì)其它殺蟲(chóng)劑和異源物質(zhì)的耐受力提高。
　　三、飛蝗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)和蛋白特性研究<

6、br>　　在大腸桿菌中成功表達(dá)并經(jīng)過(guò)純化獲得可溶性蛋白LmGSTt1和LmGSTs1。LmGSTt1和LmGSTs1都能與CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)和p-NBC(p-nitro-benzyl chloride)兩種底物發(fā)生反應(yīng)，其中CDNB是其最適底物。在40℃以下LmGSTt1和LmGSTs1都具有較好的穩(wěn)定性。在GST的抑制劑ECA(ethacrynic acid)和RB(reactive b

7、lue)的濃度為0.05mM時(shí)，LmGSTt1的活性分別降至37±1％和6±0.1％。ECA對(duì)LmGSTt1的I50值是12.6μM。RB對(duì)LmGSTt1的I50值是4.41μM;LmGSTs1的活性分別降至81±3％和41±3％。RB對(duì)LmGSTs1的I50值是18.5μM。毒死蜱、溴氰菊酯、馬拉硫磷和西維因殺蟲(chóng)劑的濃度為0.05mM時(shí)，LmGSTt1的活性分別降至71±3％，88±2％，94±2％和83±1％，而LmGSTs1對(duì)上述