飛蝗USPs的分子特性及功能研究.pdf

1、蝗蟲是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，飛蝗Locusta migratoria是蝗蟲中導(dǎo)致蝗災(zāi)的主要類群。目前，有機(jī)磷殺蟲劑是害蟲防治的主要手段，由于抗藥性的增加，防治效果逐漸下降。為了有效控制蝗蟲為害，需要研發(fā)廣譜、高效、環(huán)境友好型的殺蟲劑。蛻皮是昆蟲特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于高等生物不存在幾丁質(zhì)，因此幾丁質(zhì)代謝途徑成為殺蟲劑設(shè)計(jì)的安全靶標(biāo)。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophospho

2、rylase，UAP）是幾丁質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶。本研究以飛蝗為研究對象，首次對飛蝗UAPs基因的序列特征、表達(dá)特性及生物學(xué)功能開展了系統(tǒng)研究，希望為蝗蟲防治提供科學(xué)依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:
　　一、飛蝗UAPs基因的獲得及聚類分析
　　采用生物信息學(xué)方法對飛蝗EST和飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫全面搜索，得到兩條序列均包含UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的保守區(qū)。根據(jù)已獲得的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行全長cDNA擴(kuò)增及測序驗(yàn)證，驗(yàn)證后的兩

3、個基因分別命名為LmUAP1和LmUAP2。Lm UAP1全長cDNA序列為1497 bp，開放閱讀框?yàn)?455 bp，編碼484aa，5'非編碼區(qū)(5'-UTR)和3'非編碼區(qū)（3'-UTR）的序列長度分別為26 bp和16 bp。LmUAP2全長cDNA序列為1519 bp，開放閱讀框?yàn)?482 bp，編碼493 aa，5'-UTR和3'-UTR的長度分別為30 bp和7 bp。對已知昆蟲UAP進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲中僅飛蝗L.mi

4、gratoria和赤擬谷盜Tribolium castaneum有兩個UAP基因，且同一物種的兩個UAP基因優(yōu)先相聚，之后與其他昆蟲的UAP聚為一起，表明昆蟲UAP間有較近的親緣關(guān)系，而與人類、小鼠、酵母等其他物種UAP關(guān)系較遠(yuǎn)。飛蝗兩個UAP之間的氨基酸一致度為71％，與目前已知昆蟲UAP的氨基酸序列一致度均不超過63％。
　　二、飛蝗UAPs基因的組織分布和發(fā)育表達(dá)變化
　　基于驗(yàn)證獲得的飛蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦

5、磷酸化酶基因cDNA序列設(shè)計(jì)特異性的表達(dá)引物，采用real-time PCR方法對兩個UAP基因在飛蝗10個不同組織部位的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:LmUAP1在所選取的飛蝗10個組織部位中均有表達(dá)，體表、脂肪體、前腸、馬氏管、胃盲囊、肌肉以及氣管中表達(dá)較高，中腸、后腸和翅中表達(dá)相對較低。LmUAP2在脂肪體中表達(dá)量最高，并與其他9個組織部位的表達(dá)量有顯著性差異。LmUAP1在5齡飛蝗幼蟲的不同發(fā)育天數(shù)都有表達(dá)，5齡第1、2天表達(dá)量最

6、高，第3-6天表達(dá)量逐漸下降，蛻皮前的第7天表達(dá)量又有所上升;LmUAP2在飛蝗5齡1-7天的表達(dá)量沒有顯著變化。
　　三、飛蝗UAPs的功能研究
　　為了進(jìn)一步研究飛蝗UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因在飛蝗生長發(fā)育過程中所起的作用，采用RNA干擾的方法，將雙鏈RNA體外合成后注射入飛蝗若蟲體內(nèi)，干擾飛蝗UAP的表達(dá)來研究該基因的功能。在飛蝗不同發(fā)育階段注射dsLm UAP1，出現(xiàn)了不同的表型。當(dāng)選擇飛蝗2

7、、5齡中期（每個齡期的第三、四天）注射時，注射組均出現(xiàn)蛻皮時間延遲、背部隆起以及表皮變軟而不能完成蛻皮等現(xiàn)象;當(dāng)選擇飛蝗2、5齡初期（每個齡期的第一、二天）注射時，注射組均出現(xiàn)四肢無力、不能進(jìn)食等現(xiàn)象，最終出現(xiàn)死亡。Lm UAP1基因不論是發(fā)育齡期的中期還是初期注射，注射后死亡率都高達(dá)100％，與注射dsGFP的對照組（5％左右）相比，具有顯著性差異。在飛蝗2、5齡初期或中期注射dsLmUAP2，均沒有出現(xiàn)可觀察的表型，也無致死現(xiàn)象。<