東亞飛蝗Parental RNAi技術(shù)體系的建立以及hunchback基因功能的研究.pdf

1、飛蝗（Locusta migratoria L.）是一種農(nóng)業(yè)重大害蟲，分布面積廣，為害嚴(yán)重。其中，東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis (Meyen)）是我國(guó)最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，從溫帶到熱帶都有分布，常爆發(fā)式為害，并能遠(yuǎn)距離遷移。由于全球氣候異常、旱澇頻繁、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境變化和大量施用化學(xué)農(nóng)藥等多方面的因素，我國(guó)蝗害發(fā)生和成災(zāi)面積又有回升趨勢(shì)。因此，加強(qiáng)對(duì)飛蝗的研究以及蝗災(zāi)的綜合治理受到人們的高度關(guān)注。而

2、且，飛蝗還是昆蟲神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和系統(tǒng)演化等方面研究的重要模式生物。近年來(lái)，在分子水平探索飛蝗的生命特征已逐漸成為熱點(diǎn)，已經(jīng)有大量的基因被克隆。因此，需要一種行之有效的方法來(lái)解讀這些基因的功能。但蝗蟲乃至整個(gè)直翅目昆蟲缺乏有效的基因功能研究手段已成為制約這一領(lǐng)域繼續(xù)向前發(fā)展的瓶頸。因此，建立蝗蟲基因功能研究的技術(shù)體系已成為首要任務(wù)。 RNAi 即RNA 干擾是一種新的“基因敲除”技術(shù)，它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有同源序

3、列的雙鏈RNA，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA 降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。由于RNAi技術(shù)特有的簡(jiǎn)單性、快速性、高效性和特異性，已經(jīng)逐漸成為一項(xiàng)極具潛力的基因功能及創(chuàng)建“功能缺失”突變體的研究技術(shù)。尤其自parental RNAi方法在紅粉甲Tribolium castaneum的成功建立為一些非模式昆蟲的基因功能研究提供了一種行之有效的技術(shù)手段。 本研究采用parental RNAi方法來(lái)建立東亞飛蝗的基因功能研究技術(shù)體系，

4、并用該方法研究東亞飛蝗hunchback基因的功能?，F(xiàn)將主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下： ① hunchback基因的克隆 采用PCR、RT-PCR、RACE等方法克隆了東亞飛蝗的hunchback基因，得到hunchback基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)出氨基酸序列，分別登錄到GenBank，登錄號(hào)為DQ340870和ABC69039.1。東亞飛蝗hunchback基因cDNA全長(zhǎng)3774bp，開放閱讀框?yàn)?/p>

5、5-2545，共編碼846個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白分子量為92.09 kDa。Hunchback蛋白共有8個(gè)鋅指因子：氮端2個(gè)（NF-1、NF-2）、中間4個(gè)（MF-1、MF-2、MF-3和MF-4）和碳端2個(gè)（CF-1、CF-2）。除此之外，還有A Box、C Box和Basic Box等結(jié)構(gòu)域。 ② 東亞飛蝗parental RNAi 通過體外轉(zhuǎn)錄制備dsRNA，將dsRNA直接注射到東亞飛蝗雌成蟲的血腔里。注射dsRNA

6、后，所有的蝗蟲都存活下來(lái)，一周后開始陸續(xù)產(chǎn)卵。與對(duì)照相比，注射dsRNA蝗蟲的產(chǎn)卵量沒有明顯差異，說明dsRNA不影響蝗蟲的生殖力。 采用ELISA的方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)卵后42h的胚胎中Hunchback蛋白的相對(duì)含量，通過相對(duì)含量的變化來(lái)證實(shí)基因的沉默情況。同時(shí)，為了驗(yàn)證RNAi作用的特異性，選擇組成性表達(dá)的β-tubulin作為內(nèi)源基因?qū)φ铡Ｅc對(duì)照相比注射dsRNA胚胎的Hunchback蛋白含量下降了將近4倍，而β-tubuli

7、n蛋白沒有變化。說明RNAi特異性地抑制了內(nèi)源靶基因的沉沒，而沒有對(duì)其他基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。 產(chǎn)下的卵放在30℃保濕培養(yǎng)，發(fā)育到第6天或快孵化時(shí)，進(jìn)行胚胎表型的分析。與發(fā)育正常的卵相比，RNAi的卵要稍微小一些。根據(jù)胚胎表型的嚴(yán)重程度，可以將hunchback基因沉默后的表型分為3類。 表型I：頜、胸部體節(jié)發(fā)育正常，腹部嚴(yán)重縮短，胸足畸形，占8.4％。 表型II：頜、胸部完全缺失，僅形成了前頭部和一個(gè)縮短的腹部，

8、占86.0％。前頭部包括復(fù)眼、上唇和觸角，由于大面積組織缺失，兩個(gè)復(fù)眼長(zhǎng)到了一起，形成典型的“V”形復(fù)眼。腹部?jī)H形成了6-7個(gè)腹節(jié)，缺失了3-4個(gè)腹節(jié)。 表型III：頜部、胸部和腹部完全缺失，僅形成前頭部，包括復(fù)眼、上唇和觸角，占1.9％。 ③ RNAi作用的持續(xù)性 產(chǎn)下的第一個(gè)卵塊幾乎100％的都表現(xiàn)出RNAi表型，隨后產(chǎn)下的卵塊RNAi表型的比例逐漸下降，第5個(gè)卵塊已經(jīng)沒有RNAi作用。說明RNAi的抑制作用

9、是持續(xù)的但逐漸減弱的，東亞飛蝗RNAi的抑制作用能夠持續(xù)19天左右。 ④ 東亞飛蝗RNAi的影響因素 劑量：本研究采用了20μg、2μg、0.2μg和0.02μg dsRNA/蟲四個(gè)梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的降低RNAi的作用迅速減弱，20μg和2μg dsRNA/蟲幾乎100％都產(chǎn)生RNAi表型，而0.02μg dsRNA/蟲的劑量不能產(chǎn)生RNAi作用。說明dsRNA分子抑制hunchback基因具有劑量依賴性。

10、 注射時(shí)間：本實(shí)驗(yàn)從第5齡末的若蟲到羽化后第10天的成蟲，均注射相同劑量的dsRNA（20μg dsRNA），每種處理至少做5個(gè)重復(fù)，結(jié)果僅第7天的成蟲產(chǎn)生了RNAi作用。 不同長(zhǎng)度dsRNA ：本研究中注射了3個(gè)長(zhǎng)度分別為370 、533和1085 bp的dsRNA，結(jié)果處理之間沒有顯著差異。說明dsRNA的長(zhǎng)度對(duì)RNAi的作用沒有明顯的影響。 ⑤ hunchback基因的功能 東亞飛蝗hunchback基因的

11、parental RNAi產(chǎn)生了3種表型，其中表型II的頜部、胸部完全缺失，最嚴(yán)重的表型III僅形成了前頭部，包括觸角、復(fù)眼和上唇，其余部分全部缺失。表明東亞飛蝗hunchback基因在頜部和胸部區(qū)域起著典型的間隙基因的功能，調(diào)控頜、胸部體節(jié)的形成。 RNAi使腹部發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷，表現(xiàn)為腹節(jié)缺失，僅形成6-7個(gè)腹節(jié)，或腹部?jī)H形成一團(tuán)紊亂的組織，沒有形成明顯的腹節(jié)。因此，hunchback基因不但是腹部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的需要，也是腹部分

12、節(jié)所必須的調(diào)控基因。 ⑥ hunchback功能的進(jìn)化 昆蟲從短胚帶向長(zhǎng)胚帶演化的過程中，hunchback基因的部分功能逐漸為其他基因所替代。因此，在低等昆蟲中hunchback基因調(diào)控的體節(jié)數(shù)比高等昆蟲的多。 Hunchback蛋白是含有鋅指因子的轉(zhuǎn)錄因子，中間鋅指因子（MF1-4）和碳端鋅指因子（CF1-2）較為保守，從環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲到節(jié)肢動(dòng)物都有，而氮端鋅指因子（NF1-2）則隨著系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化而逐漸丟失。