rnai用于基因功能的鑒定和確證

1、,RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鑒定和確證,廣州復(fù)能基因有限公司李華平博士 研發(fā)部主任,FulenGen,FulenGen,Gene Function Screening,Mechanism of RNAi (shRNA/miRNA),Comparison of shRNA and miRNA properties,Architecture s

2、hort hairpin Single-strandOriginal Exogenous EndogenousNo. of intended target 1 ManyDegree of

3、gene silence High LowComplementary to mRNA target Perfect ImperfectEffect on mRNA Endonucleolytic cleavage Repressed

4、translation,shRNA miRNA,FulenGen,FulenGen,shRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 shRNA的驗(yàn)證 miRNA的克隆與檢測 miRNA靶標(biāo)的確證 基因沉默后的功能拯救,FulenGen,FulenGen,shRNA 表達(dá)克隆的構(gòu)建,載體選擇 篩選標(biāo)記和報(bào)告基因 目的細(xì)胞,shRNA序列設(shè)計(jì) 高準(zhǔn)確性的預(yù)測方法

5、 莖和環(huán)序列,有效性檢測 3-5個shRNA /基因 目的基因是否表達(dá),克隆和測序 合成引物的長度 莖環(huán)結(jié)構(gòu)難以有效測序,保證高表達(dá)抑制效率和最低的脫靶效應(yīng)； 慢病毒載體和以哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體；序列已經(jīng)過測序；每個基因提供4個克隆，至少有1抑制水平達(dá)到70%以上提供包含不規(guī)則序列的陰性對照克隆來比較研究。,OmicsLink? shRNA表達(dá)克隆,FulenGen,經(jīng)過

6、驗(yàn)證的人類激酶組shRNA表達(dá)克隆 350個人類激酶基因的確證shRNA表達(dá)克隆 表達(dá)抑制效應(yīng)都經(jīng)過驗(yàn)證，達(dá)70％以上 低的脫靶效應(yīng)。,FulenGen,shRNA克隆用于信號通路研究,qPCR Primer array 即將上市,采用先進(jìn)的算法，精心設(shè)計(jì)的qPCR引物 擴(kuò)展長度100－250bp； PCR擴(kuò)展效率>90%； 每對引物的都經(jīng)過擴(kuò)展曲線、溶解曲線

7、和電泳檢測，包括擴(kuò)展的特異性,,,,,,,,ExonicNon-coding,MicroRNAs 由RNA Polymerase II轉(zhuǎn)錄,IntronicNon-codingand coding,Lee, et al., EMBO J. 23:4051-60 2004,/~-OH,mature and primary microRNA 的結(jié)構(gòu),Pri-miRNA,Drosha Cleavage site,Mature,,,Ve

8、ctor-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,III 型啟動子,II 型啟動子,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,OmicsLink? Human Precursor miRNA Expression Clones,,pEZ-MR02,650種前體miRNA表達(dá)克隆涵蓋了miRBase（11.0版本）中已知的678種miRNA

9、的95% miRNA表達(dá)框已完全測序確證 基于慢病毒載體系統(tǒng)的表達(dá)克隆可轉(zhuǎn)染未分化細(xì)胞和難轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，獲得與普通分化細(xì)胞類似的轉(zhuǎn)染效率 提供被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活性的篩選基因，可用于穩(wěn)定或瞬時表達(dá)調(diào)控 通過應(yīng)用eGFP可以監(jiān)測病毒和質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率,FulenGen,miRNA與腫瘤,miRNA的檢測和定量,檢測方法 Nothernblot Microarray Quantitative Real-time PCR,檢測對象

10、 Primary-miRNA Pre-miRNA Mature miRNA,FulenGen,Quantitative Real-time PCR detect miRNA,polyA加尾法,Loop反轉(zhuǎn)錄法,通用性高；適用于同一樣本檢測多種miRNA經(jīng)濟(jì)、方便,特異性高；適用于多個樣本中檢測同一miRNA價格較高,FulenGen,qPCR 檢測miRNA的特異性,qPCR檢測miRNA的特異性,qPCR 檢測miRNA困

11、難,采用LNA探針,miRNA Target的分析,研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，miRNAs的基因抑制作用是通過其5’一段長為6－8nt的核苷酸與mRNAs3’端非翻譯區(qū)域相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。一般這段核苷酸位于 miRNA序列5’的2~8個nt，被稱為seed區(qū)。2007年，美國約翰·霍普金斯大學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-29b 5’的6個核苷酸與該miRNA的細(xì)胞定位有關(guān)。,FulenGen,miRNA 5’的seed區(qū)域在miRNA家族中具有很

12、高的保守性，對脊椎動物的miRNA target的識別具有重要的作用，尤其是第2-8個堿基。,FulenGen,針對HDAC5的三個不同版本的算法的microRNA的預(yù)測結(jié)果,紅色表示第三和第四版重疊的microRNA，黃色表示第四和第五版重疊的microRNA,,,microRNA,Translation,DegradeationOr Translation inhibition,Light,No Light,Renilla Luc

13、iferase data,Firefly Luciferase data,miRNA的編輯及其靶標(biāo)的變化,miR376a-5p 經(jīng)過編輯后，其靶標(biāo)的變化,FulenGen,OmicsLink? Human miRNA Target Sequence (3’ UTR) Expression Clones,pEZX-MT01,pEZX-MT02,FulenGen,Gaussia luciferase expression in CHO ce