苔類植物聯(lián)芐合成相關(guān)基因功能鑒定及催化機制研究.pdf

1、苔蘚植物是介于藻類和蕨類植物之間的一個非常重要的植物類群，可以分為苔綱、蘚綱和角苔綱。苔類植物富含萜類和芳香類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣并具有多種多樣的生物活性，如抗真菌、細胞毒、昆蟲拒食、自由基清除等，因此苔類植物成為生物活性天然產(chǎn)物的寶庫。但是由于苔類植物本身的生長環(huán)境特殊、個體矮小且往往種間雜生，很難富集到大量的高純度的材料進行研究。分子生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展為解決該問題提供了一個途徑。前人通過同位素追蹤法提出了苔類植物中雙聯(lián)芐類化合物

2、的生物合成途徑，但是對于催化其生物合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶研究的還比較少，因此，尋找催化苔類植物次級代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶，闡明重要次級代謝物的生物合成途徑，通過代謝工程手段提高天然活性產(chǎn)物的含量，是解決活性化合物來源的一個重要途徑。
　　本研究通過篩選cDNA文庫EST測序以及轉(zhuǎn)錄組測序等方法得到了鈍鱗紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)和粗裂地錢（Marchantia paleacea）中聯(lián)芐類化合物生物

3、合成途徑的關(guān)鍵酶基因，并對其中兒個進行了詳細研究。包括苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶苯丙氨酸裂解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)，鑒定了其體外生化特征并對非生物脅迫條件下PAL的表達與聯(lián)芐含量的關(guān)系進行了初步探討;克隆了兩個細胞色素P450基因，對其基因結(jié)構(gòu)、表達特征進行了分析，發(fā)現(xiàn)其與聯(lián)芐生物合成具有一定的相關(guān)性;對苔類植物中克隆得到的兩類羧酸芪類合成酶(stilbenecarboxylate s

4、ynthase，STCS) STCS1和STCS2的進行了體外酶活分析，對其底物選擇性進行了初步探討，并獲得了STCS1的蛋白晶體，收集到高分辨數(shù)據(jù)，對其可能的選擇機制進行了初步闡述。主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括:
　　1.苔類植物聯(lián)芐合成途徑——苯丙烷代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶，苯丙氨酸裂解酶(PAL)的克隆及功能研究
　　從鈍鱗紫背苔cDNA文庫EST測序結(jié)果中得到一個注釋為苯丙氨酸裂解酶(PAL)的基因片段，通過5'RACE方法

5、得到其全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析顯示，與其他植物來源的PALs具有60-75％的同源性，具有Ala-Ser-Gly催化三聯(lián)體和其他保守活性氨基酸，同源建模模擬得到其三維結(jié)構(gòu)模型，與來自歐芹的PcPAL整體折疊和保守結(jié)構(gòu)域類似，這些分析表明其是一個苯丙氨酸裂解酶，命名為PaPAL。對其進化地位進行分析，結(jié)果表明PaPAL與蕨類、苔蘚類和裸子植物的PALs親緣關(guān)系比較近，與傳統(tǒng)的植物進化進程一致。另外，以基因組DNA為模板擴增得到基因

6、序列，與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，基因編碼區(qū)只有一個外顯子，沒有內(nèi)含子。
　　構(gòu)建PaPAL的原核表達載體并且轉(zhuǎn)入表達型大腸桿菌BL21(DE3)中進行蛋白的誘導(dǎo)表達。對純化后的蛋白進行體外酶活鑒定，結(jié)果顯示PaPAL能夠高效的催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸，并能夠以L-酪氨酸為底物產(chǎn)生對羥基肉桂酸，是一個雙功能酶，但對兩種底物的催化效率有差別，酶學(xué)動力學(xué)分析表明L-苯丙氨酸是PaPAL的最適底物。此外，PaPAL的表達受到激素茉莉酸甲酯

7、(MeJA)和脫落酸(ABA)的誘導(dǎo)，而且激素誘導(dǎo)條件下葉狀體聯(lián)芐含量與PaPAL的表達有一定的正相關(guān)。
　　2.查爾酮合成酶家族基因的克隆和功能研究
　　通過對粗裂地錢在特定配子體階段轉(zhuǎn)錄組進行測序，得到一些標(biāo)注為查爾酮合成酶基因的序列，選取其中4個克隆進行全長cDNA序列擴增，得到基因序列和數(shù)據(jù)庫中的MpSTCS1，2具有較高同源性，因此被命名為MPaSTCS1-4。對克隆得到的STCSs序列進行分析，它們與其他CHSs

8、有很高的同源性，并具有保守的催化位點Cys-His-Asn及其他保守氨基酸，表明他們都屬于CHS超家族，可能具有查爾酮合成酶功能。
　　構(gòu)建STCSs基因的原核表達體系，得到純化的蛋白并進行體外酶活檢測，發(fā)現(xiàn)這4個STCSs根據(jù)催化底物酶活效率的不同可以分為兩類。以二氫對羥基香豆酰輔酶A(dihydro-p-coumaroyl-CoA)為起始底物，它們都能夠發(fā)生C6/C1環(huán)化生成根皮素(phloretin)和內(nèi)酯化產(chǎn)物dihydr

9、o-4-coumaroyltriacetic acid lactone(dihydro-CTAL)和dihydrobisnoryangonin(dihydro-BNY)。但是以對羥基香豆酰輔酶A(p-coumaroyl-CoA)為起始底物時，MPaSTCS2能夠催化發(fā)生C6/C1環(huán)化生成柚皮素，而另外3個STCSs與STCS2催化效率相差很人，只能生成痕量的柚皮素（質(zhì)譜檢測到），主要產(chǎn)物是內(nèi)酯化的α-吡喃酮衍生物CTAL和BNY。這兩類

10、STCSs對這兩種底物具有明顯的選擇性，但是現(xiàn)有的研究結(jié)果還無法解釋這種差異的來源，我們期望從結(jié)構(gòu)角度來解釋這種差異，并進一步闡明催化機制。我們選取MPaSTCS1進行進一步的晶體學(xué)研究。
　　3.對STCS1蛋白的初步晶體學(xué)研究
　　利用大腸桿菌系統(tǒng)進行STCS1表達，純化得到大量單一的STCS1蛋白，初步篩選得到微晶。然后優(yōu)化結(jié)晶條件，得到較大的晶體進行衍射實驗，獲得2.4(A)高分辨的衍射數(shù)據(jù)，通過分子置換、模型修正等

11、方法，得到STCS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。STCS1的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)功能二聚體形式，每個不對稱單位中含有六個STCS1分子。STCS1單體包含上下兩個結(jié)構(gòu)域，總體呈現(xiàn)出αβαβα假對稱模式，上下部分之間有一個裂縫，形成活性空腔。將其與同源蛋白MpSTCS2和MsCHS進行結(jié)構(gòu)比對，發(fā)現(xiàn)三者的三維結(jié)構(gòu)非常類似，僅在活性位點附近有細微的差別。將STCS1晶體結(jié)構(gòu)分別與底物和產(chǎn)物分子進行對接，分析與底物分子或產(chǎn)物分子相互作用的氨基酸殘基及作用特點，并

12、與經(jīng)典的CHS和底物/產(chǎn)物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進行比較，尋找STCS1與CHS催化活性位點的差別，從結(jié)構(gòu)角度解釋STCS1與CHS對底物選擇性差別。
　　4.次級代謝途徑相關(guān)P450的克隆及功能初步研究
　　分析鈍鱗紫背苔cDNA文庫EST測序結(jié)果，找到幾十個標(biāo)注為細胞色素P450的序列。選取其中幾個在愈傷組織、培養(yǎng)的葉狀體及野生型葉狀體中進行表達分析，發(fā)現(xiàn)其中幾個基因在聯(lián)芐含量高的組織中表達量明顯升高，推測可能與其聯(lián)芐的合成代謝

13、相關(guān)。
　　選取其中兩個基因通過5' RACE方法克隆了它們的全長，并擴增得到它們的cDNA及基因組序列，發(fā)現(xiàn)兩個基因的編碼區(qū)都有2個內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析顯示，它們屬于P450家族，與CYP75家族具有較高的同源性，具有P450的保守結(jié)構(gòu)域，包括高度保守的血紅素結(jié)合部位FxxGxRxCxG和另外幾個P450s的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域和序列A/GGxD/ETT/S(I-helix)，KETLR(K-helix)和PERF/W等。構(gòu)建了P45