病毒誘導的基因沉默體系及小麥SBEIIb基因功能的研究.pdf

1、VIGS（virus induced gene silencing，VIGS）技術是一種RNA介導的植物防御機制，是指攜帶目的基因片段的載體病毒進入植物后，可誘導植物內源基因沉默，其分子基礎可能是轉錄后基因沉默PTGS(post-transcript gene silence，PTGS)。VIGS被視為研究植物基因功能的強有力工具。大麥條紋花葉病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)，由于其寄主范圍廣而成為

2、單子葉植物優(yōu)良的載體，為小麥基因功能的研究提供了有效的工具。為了給以后利用VIGS技術開展小麥淀粉合成酶基因功能的研究提供理論依據和技術指導，本研究選擇小麥PDS(Phytoene Desaturase)基因與淀粉合成關系較密切的SBEIIb(Starch-branching enzyme IIb)基因為靶基因，以PDS基因為指示基因，分別構建目的基因片段的BSMV-VIGS載體，接種在小麥葉片和幼穗上，在不同溫度條件、接種方法、接種量

3、的處理下，誘發(fā)植物發(fā)生基因沉默，并對其進行定性定量分析，建立小麥穗部相對最優(yōu)的VIGS體系，并利用該體系進行了SBEIIb基因功能的初步研究。
　　本研究主要內容包括：⑴克隆了小麥PDS基因片段和SBEIIb基因片段，并構建其VIGS重組載體。⑵選擇注射法和摩擦法分別侵染抽穗期的小麥穗部，結果發(fā)現，采用兩種方法接種的植株均在5-8 dpi(days post infection)出現明顯的光漂白現象，在15 dpi光漂白現象明顯擴

4、大，在23-26 dpi光漂白程度最大。采用注射法接種的侵染成功率只有20％，而摩擦法接種的侵染成功率為90%。接種旗葉的表型變化與接種穗部的相似。由于基因沉默延遲，在接種旗葉20 dpi左右，穗部才觀察到光漂白現象。采用摩擦法接種小麥幼穗后，放在21-24℃和26-29℃的不同溫度下培養(yǎng)。結果發(fā)現，在兩個環(huán)境中培養(yǎng)的植株病毒侵染成功率均在90%左右。在26-29℃較高溫度下，病毒發(fā)展過快，癥狀過重，掩蓋了基因沉默的光漂白表型，并且發(fā)生

5、了其他的嚴重病害，影響了接種材料表型觀察及分子檢測。此外，在26-29℃環(huán)境下的植株還表現出灌漿不充分和不能結實的現象。接種次數對VIGS誘導基因沉默的影響只是提高了接種成功率，其他并無明顯變化。因此，選擇摩擦法接種小麥穗部，在21-24℃培養(yǎng)更優(yōu)。⑶選取出現光漂白植株的小穗及相應時期的對照組進行色素含量測定及 PDS基因相對表達量的測定。結果顯示，葉綠素a及類胡蘿卜素的含量均在20 dpi分別下降83.6%和91.4%。葉綠素b的含量

6、在12-20 dpi減少超過60%。在20 dpi前后，葉綠素總含量減少80.5%。在接種后3 d PDS基因相對表達量下降了50%左右，在第9-20 dpi，維持在一個相對較低的水平（約10%），在25 dpi之后有所上升。說明葉綠素含量的降低是由PDS基因沉默引起的。⑷在小麥抽穗期，將攜帶SBEⅡb的BSMV侵染小麥，在接種后第6，9，12，15和20 d分別提取總RNA，進行實時熒光定量PCR檢測。結果顯示，與對照相比，SBEⅡb