東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因克隆及其功能研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)是分布于脊椎動物膽堿能神經(jīng)節(jié)、線蟲及無脊椎動物神經(jīng)肌肉接頭處的重要水解酶。在生物體內(nèi)，它能特異性催化乙酰膽堿的水解反應(yīng)，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。由于有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑能特異性抑制乙酰膽堿酯酶的活性，阻斷乙酰膽堿的水解，使乙酰膽堿在突觸間隙積累并引起昆蟲中毒死亡，因此乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺

2、蟲劑的作用靶標(biāo)。
　　 東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis，Meyen)是我國重點(diǎn)防治的遷飛性農(nóng)牧業(yè)害蟲。目前，有機(jī)磷殺蟲劑仍然是殺滅東亞飛蝗的主要化學(xué)農(nóng)藥。在長期的選擇壓力下，東亞飛蝗有機(jī)磷殺蟲劑抗性種群已經(jīng)產(chǎn)生。
　　 對東亞飛蝗自然種群乙酰膽堿酯酶敏感性的對比研究結(jié)果顯示：抗性種群乙酰膽堿酯酶對毒死蜱、內(nèi)吸磷、對硫磷的敏感性分別是敏感種群的62倍、2.0倍和1.6倍。因此，不敏感型

3、乙酰膽堿酯酶很可能是引起東亞飛蝗殺蟲劑抗性的機(jī)制。盡管不敏感型乙酰膽堿酯酶已被證明是引起許多昆蟲抗藥性的重要機(jī)制，但對東亞飛蝗而言，由于未知其乙酰膽堿酯酶基因序列，因此不敏感型乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。
　　 本研究通過比對昆蟲乙酰膽堿酯酶蛋白質(zhì)序列，找出其氨基酸保守區(qū)域，兼顧東亞飛蝗密碼子使用頻率，設(shè)計(jì)簡并引物，PCR擴(kuò)增東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因保守片段；以東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因保守序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)基因特異性

4、引物，采用RACE技術(shù)擴(kuò)增東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶cDNA全長；在得到東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶cDNA全長的基礎(chǔ)上，通過基因干擾和基因表達(dá)研究東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶的功能。東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因的克隆及其功能研究，有助于從分子水平上闡明東亞飛蝗有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性產(chǎn)生的分子生物學(xué)機(jī)制，對于開發(fā)新型化學(xué)及生物殺蟲劑具有十分重要的意義。
　　 1.乙酰膽堿酯酶基因的克隆
　　 以東亞飛蝗基因組DNA為模板，用根據(jù)乙酰膽堿酯

5、酶保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，獲得了一個(gè)263 bp的基因片段。生物信息學(xué)分析表明，該片段編碼的氨基酸序列與德國小蠊(Blattella germanica)AChE1有93％的相似性，與嗜卷書虱(Liposcelis bostrychophila)AChE有90％的相似性，與黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)AChE2有89％的相似性。
　　 在東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶保守序列基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)基因特異性引

6、物，采用RACE技術(shù)克隆了東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因，登錄到GenBank，登錄號為EU231603。克隆到的東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因cDNA序列長2255bp，開放閱讀框長1638bp，共編碼546個(gè)氨基酸，5'-和3'-端非編碼區(qū)分別長286bp和328bp。
　　 進(jìn)化樹分析表明，該基因的編碼產(chǎn)物屬于Ⅰ型乙酰膽堿酯酶，其一級結(jié)構(gòu)具有如下乙酰膽堿酯酶的共同特征：①保守的催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)，即S151(S200 inTorped

7、o)，E277(327)和H391(440)；②膽堿結(jié)合位點(diǎn)W36(W84 in Torpedo)；③形成鏈內(nèi)二硫鍵的6個(gè)半胱氨酸(C67-C94、C254-C265、C402-C521 in Torpedo)，東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶有5個(gè)保守的半胱氨酸(C26，C205-C218和C353-C519)，缺乏形成第一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的第一個(gè)半胱氨酸；④形成催化谷內(nèi)襯的14個(gè)芳香族氨基酸殘基(Y70、W84、W114、Y121、Y130、W23

8、3、W279、F288、F290、F330、F331、Y334、W432和Y442 in Torpedo)，有12個(gè)在東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶中保守(W36、W66、Y73、Y82、W184、W232、F240、F242、F280、F281、Y284和W373)；⑤包含絲氨酸活性位點(diǎn)的FGESAG序列，該序列在所有膽堿酯酶中保守。
　　 2.東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶與有機(jī)磷抗性之間的關(guān)系
　　 將體外轉(zhuǎn)錄制備的乙酰膽堿酯酶基因特

9、異性dsRNA注射到東亞飛蝗四齡若蟲血腔，檢測dsRNA介導(dǎo)的基因沉默情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在mRNA水平上，乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)下調(diào)了46.14％；ELISA結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水平上，乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)下調(diào)了47.36％；酶活測定結(jié)果顯示，乙酰膽堿酯酶基因干擾組東亞飛蝗的乙酰膽堿酯酶比活是對照組的40％。說明RNA干擾能特異性沉默東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶基因的表達(dá)。
　　 馬拉硫磷敏感性測定結(jié)果顯示，干擾組蝗蟲半數(shù)致

10、死劑量LD50為1.73μg/頭，對照組LD50為4.34μg/頭，兩者存在顯著性差異(p＜0.05)。該結(jié)果提示乙酰膽堿酯酶基因干擾會引起東亞飛蝗馬拉硫磷敏感性增加，說明該乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷殺蟲劑作用靶標(biāo)和東亞飛蝗有機(jī)磷殺蟲劑抗性相關(guān)基因。
　　 3.東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶的表達(dá)
　　 構(gòu)建了東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶真核表達(dá)載體，獲得了高表達(dá)畢赤酵母菌株，經(jīng)2.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)九天，其表達(dá)量可達(dá)500μg·mL-1。畢赤酵