家蠶兩種類型乙酰膽堿酯酶基因的分析.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholineste7ase，AChE，EC3.1.1.7.)是昆蟲神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，在膽堿能神經(jīng)突觸間，通過(guò)催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ATCh)來(lái)維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞。AChE是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。由于殺蟲劑的大規(guī)模長(zhǎng)期的使用，不僅帶來(lái)巨大的環(huán)境污染，而且導(dǎo)致許多種昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。家蠶是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)農(nóng)藥十分敏感的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是我國(guó)農(nóng)藥登記中所列

2、環(huán)境生態(tài)的非靶標(biāo)生物之一。農(nóng)、林害蟲中約有70％的種屬于鱗翅目，而家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表已有長(zhǎng)久歷史，所以研究家蠶的乙酰膽堿酯酶基因，可為開發(fā)對(duì)害蟲高效而對(duì)環(huán)境沒有污染的新型藥劑提供科學(xué)依據(jù)，不僅可以縮短藥劑研發(fā)周期，大幅降低研發(fā)成本，還可望開拓農(nóng)林害蟲新的防治途徑。本研究以家蠶乙酰膽堿酯酶作為研究對(duì)象，初步研究了家蠶乙酰膽堿酯酶的生化特性，并設(shè)計(jì)了特異性的引物，首次擴(kuò)增得到家蠶兩種類型的ace基因，為家蠶中存在兩個(gè)ace的編碼坐位提

3、供了證據(jù)，與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)了家蠶aces的基因結(jié)構(gòu)；同時(shí)將兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞進(jìn)行了表達(dá)研究，制備了多克隆抗體，初步研究了在細(xì)胞中表達(dá)的家蠶乙酰膽堿酯酶的功能。同時(shí)我們表達(dá)并回收了家蠅的乙酰膽堿酯酶。主要研究結(jié)果如下： 1、對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶(AChE)的生化特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，家蠶AChE水解乙酰膽堿(ATCh)的效率明顯高于丙酰膽堿(PTCh)和丁酰膽堿(BTCh)。在pH8.0和37℃下

4、，酶的活力最高，對(duì)氧磷和毒扁豆堿對(duì)家蠶AChE酶的抑制中濃度I50分別為9.8×10-7M和4.8×10-7M，同時(shí)與蜜蜂和家蠅等昆蟲比較的結(jié)果，表明家蠶的乙酰膽堿酯酶的活性只維持在較低的水平，這可能也是家蠶對(duì)有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑很敏感的一個(gè)原因。 2、首次克隆到編碼家蠶乙酰膽堿酯酶的兩個(gè)基因，分別命名為Bmacel和Bmace2，為家蠶乙酰膽堿酯酶的雙基因編碼提供了直接的證據(jù)。1型家蠶乙酰膽堿酯酶基因全長(zhǎng)3851bp，被

5、2個(gè)內(nèi)含子隔開。2型家蠶ace基因全長(zhǎng)大約27kb，基因內(nèi)含有5個(gè)內(nèi)含子。Bmacel基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為2052bp，預(yù)計(jì)編碼683個(gè)氨基酸殘基，SignalP預(yù)測(cè)到一個(gè)17氨基酸殘基的信號(hào)肽。Bmace2編碼區(qū)長(zhǎng)度為1917bp，編碼一個(gè)638個(gè)殘基的蛋白，預(yù)測(cè)有一個(gè)23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。同時(shí)將兩個(gè)基因與電鰩，果蠅等其它昆蟲序列聯(lián)配的結(jié)果表明，該基因具有乙酰膽堿酯酶基因的特性：保守的催化三聯(lián)體，6個(gè)半胱氨酸殘基形成三對(duì)二硫鍵，保守的

6、氧陰離子洞，保守的FGESAG基序。 3、利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，大量表達(dá)了融合蛋白GST-AChEl和GST-AChE2，并采用傳統(tǒng)的割膠回收的方法，回收了兩種蛋白，將兩種表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔，制備了兔抗多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)表明，兩種抗體的效價(jià)均為1：6.4×104。 4、將克隆好的兩個(gè)基因分別在Bac-to-Bac系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，同時(shí)為了提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量，分別構(gòu)建了去除蛋白C端疏水肽的載體，并分別進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)

7、果表明，家蠶乙酰膽堿酯酶基因在該系統(tǒng)中得到了正確的表達(dá)，但是僅表現(xiàn)出相對(duì)較低的活性，糖染色分析證實(shí)家蠶乙酰膽堿酯酶是一種糖蛋白。與其它幾種昆蟲乙酰膽堿酯酶的活性比較也發(fā)現(xiàn)家蠶的乙酰膽堿酯酶活性比較低，抑制實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)毒扁豆堿和對(duì)氧磷更為敏感。2型乙酰膽堿酯酶的Ⅰ50比1型的偏低。 5、克隆了家蠅敏感品系的乙酰膽堿酯酶基因，并分別將該基因轉(zhuǎn)入原核和真核表達(dá)載體進(jìn)行了表達(dá)，在大腸桿菌里的表達(dá)產(chǎn)物為無(wú)活性的包涵體，蛋白復(fù)性后也

8、僅表現(xiàn)出很低的活性。真核表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性，我們大量表達(dá)了該蛋白,并利用鹽酸普魯卡因胺親和層析的方法，純化了該蛋白，蛋白純化倍數(shù)為41倍，蛋白回收率為17.94％。細(xì)胞里表達(dá)的粗酶液和純化后的產(chǎn)物對(duì)對(duì)氧磷和毒扁豆堿的抑制實(shí)驗(yàn)表明純化后的乙酰膽堿酯酶對(duì)兩種抑制劑敏感性都有所下降。 6、利用Paupver4.0軟件包，采用鄰接法進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶的進(jìn)化分析。昆蟲的ace進(jìn)化主要分為兩大分支，第Ⅰ分支包括同翅目、雙翅目、鱗翅