乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的研究.pdf

1、食品中農(nóng)藥殘留一直是人們關(guān)注的熱點問題，有機磷類農(nóng)藥抑制人體血液和組織中膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致食品安全事件經(jīng)常發(fā)生。建立一種準(zhǔn)確快速、簡單廉價的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)是食品安全和環(huán)境保護的當(dāng)務(wù)之急。本文對鯽魚腦中乙酰膽堿酯酶的提取、純化工藝進行了優(yōu)化，對已純化的AChE活性影響因素進行了優(yōu)化，對所得乙酰膽堿酯酶進行了固定化及熒光生物傳感器制備研究。
　　以鯽魚頭為原料，采用勻漿輔助Tris-Hcl浸提法提取乙酰膽堿酯酶（AChE），以響應(yīng)

2、面分析方法優(yōu)化提取工藝，得到AChE最佳提取條件：Tris-Hcl的濃度0.069mol/L，pH8.09，料液比6.28:1(mL/g)，勻漿時間7.1min（每15s間隔5s），得出最大酶的比活力為158.25U/mg。粗酶液經(jīng)硫酸銨分級鹽析、SephadexG-200凝膠色譜純化得到酶的比活力為343.98U/mg,純化2.17倍，經(jīng)SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)兩條帶，其純度接近電泳純。用酶的底物特異性和過量底物抑制作用分析已純化酶為

3、AChE。對已純化的AChE活性影響因素進行了優(yōu)化，最佳活性測定條件:底物（碘代硫化乙酰膽堿）濃度3.5mmol/L、緩沖液pH值8.0、溫度35℃,恒溫時間15min，得到最佳酶的比活力為414.91U/mg。
　　通過殼聚糖、硝酸纖維素、木耳多糖三種載體吸附-交聯(lián)法固定化AChE，比較固定化酶活力和活力回收率，確定了殼聚糖吸附-交聯(lián)法固定化AChE為最佳方案。經(jīng)正交實驗優(yōu)化得出最佳固定化條件：殼聚糖濃度0.2g/ml，給酶量7

4、0μl/cm2，在4℃下吸附12h，濃度為0.4％的戊二醛，4℃下交聯(lián)2h，得到固定化酶膜的活力和酶膜回收率分別為6.46U/cm2和44.25%。
　　本文還對固定化酶熒光傳感器檢測有機磷農(nóng)藥O，O-二甲基-（2,2,2-三氯-1-羥基乙基）磷酸酯(敵百蟲、trichlorfon)進行了研究。以異硫氰酸熒光素（FITC）為指示劑，抑制時間15min，Trichlorfon濃度1.5×10-4~1.5×10-8M內(nèi)與熒光強度呈線性