飛蝗三個P450基因的分子特性及功能分析.pdf

1、飛蝗是我國的重大農業(yè)害蟲，其引發(fā)的蝗災對農業(yè)生產造成很大的威脅。目前最主要的防治方法仍是化學防治?；瘜W農藥的施用使飛蝗產生了一定程度的抗藥性，細胞色素P450是昆蟲體內的一類解毒酶系，目前認為與抗藥性相關的P450基因多集中于CYP4、CYP6和CYP9家族中。本文以飛蝗為研究對象，經分離克隆獲得三個細胞色素P450基因，進而系統(tǒng)地研究了其分子特性和對殺蟲劑的解毒功能，為飛蝗的有效防治和抗藥性研究提供了理論依據。本文主要研究內容如下:<

2、br>　　一、飛蝗三個細胞色素P450基因的克隆和序列分析
　　基于飛蝗表達序列標簽(ESTs)和轉錄組數據庫，采用生物信息學方法搜索得到細胞色素P450基因序列，經Blast分析，選取CYP4、CYP6和CYP9家族各一條序列進行了深入研究。通過生物信息學比對方法發(fā)現，CYP6和CYP9家族基因cDNA序列已經具備了全長序列的基本保守區(qū)，而CYP4家族序列為部分片段，需要進一步獲取全長序列。采用RACE-PCR技術進行擴增，從而

3、獲得CYP4家族基因的5'端序列。進一步對三個細胞色素P450基因的全長cDNA序列進行驗證，驗證后的全長序列提交國際細胞色素P450命名委員會，分別將其命名為CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1。與果蠅中CYP4、CYP6和CYP9家族全部基因進行聚類分析，結果表明:CYP4G62全長1992bp，包含1662bp開放閱讀框，66bp5'和264bp3'非編碼區(qū);CYP6EL1全長2103bp，其中1503bp為開放閱讀框，

4、84bp5'和489bp3'非編碼區(qū);CYP9AQ1全長2103bp，包含1578bp開放閱讀框，57bp5'和935bp3'非編碼區(qū)。三個P450基因的分子量分別為63.5、58.0和60.4kDa。等電點分別為6.80、6.84和7.20。
　　二、飛蝗三個P450基因的mRNA表達模式
　　采用Real-timePCR技術檢測了細胞色素P450基因在飛蝗不同組織部位的表達。結果顯示:CYP4G62主要在肌肉和脂肪體中表

5、達，CYP6EL1主要在中腸、胃盲囊和脂肪體中表達，CYP9AQ1主要在腦和脂肪體中表達。進一步檢測飛蝗不同發(fā)育階段細胞色素P450基因的表達，結果表明:CYP4G62和CYP9AQ1在若蟲期的表達量最高，且隨著齡期的增加呈現增加的趨勢，在五齡若蟲時表達量最高，成蟲期表達量急劇下降;CYP6EL1在卵中表達量最高，其它各齡期表達量均較低。選取不同濃度的農藥點滴處理飛蝗，發(fā)現馬拉硫磷可以不同程度地誘導三個細胞色素P450基因的表達，而西維

6、因對三個細胞色素P450基因的表達沒有影響。
　　三、飛蝗三個P450基因的生物學功能研究
　　為了進一步研究飛蝗三個細胞色素P450基因的生物學功能，采用RNA干擾(RNAi)技術，將體外合成的雙鏈dsRNA注入飛蝗體內，進一步點滴農藥，研究其對農藥的敏感性。結果顯示:飛蝗體內注入dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后點滴毒死蜱，與對照相比，其死亡率分別增加了29.35％和17.35％;點滴西維因后，死亡率分別增加19.

7、94％和31.04％。飛蝗體內注射dsCYP4G62、dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后分別點滴溴氰菊酯，其死亡率分別增加26.88％、33.78％和20.53％。表明CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1對溴氰菊酯具有一定的解毒作用，同時CYP6EL1和CYP9AQ1對毒死蜱和西維因有解毒作用，但三個細胞色素P450基因對馬拉硫磷和DDT均無解毒功能。
　　本文以飛蝗為研究材料，通過克隆獲得三個細胞色素P450基因