野桑蠶細(xì)胞色素P450基因的研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450單加氧酶系是一種廣泛分布于各種需氧生物體內(nèi)的氧化酶系，由多種成分組成。很多證據(jù)表明，昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的代謝抗性是大多數(shù)昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性和對(duì)寄主植物適應(yīng)性的主要機(jī)制?！　∫苑镎T導(dǎo)的野桑蠶中腸組織為基礎(chǔ)材料，根據(jù)家蠶CYP305B1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR分兩段擴(kuò)增了野桑蠶的CYP305B1V1cDNA基因；通過(guò)拼接獲得了完整CYP305B1V1基因。測(cè)序結(jié)果顯示，野桑蠶CYP305B1V1基因

2、的ORF為1464nt，編碼487aa，具有細(xì)胞色素P450蛋白的共同特征。同源性分析表明，在DNA水平上，野桑蠶CYP305B1V1基因與家蠶CYP305B1基因的同源性達(dá)99.18％，而推導(dǎo)的氨基酸序列則完全一致。通過(guò)NCBI中家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)、比對(duì)和拼接，預(yù)測(cè)野桑蠶CYP305B1V1基因結(jié)構(gòu)中至少含有7個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子-外顯子之間的連接符合GT-AT法則?！　YP305B1V1的cDNA序列克隆進(jìn)原核pET28a(+

3、)，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE、Westeronblotting分析表明，帶有His6標(biāo)簽的重組CYP305B1V1蛋白的分子量為57kDa左右，與理論值相符。為通過(guò)純化蛋白，進(jìn)一步構(gòu)建細(xì)胞色素P450的體外代謝體系奠定了基礎(chǔ)?！　〕樘岵煌瑮l件下野桑蠶的各組織總RNA，利用DIG標(biāo)記的隨機(jī)引物制備了野桑蠶CYP305B1V1cDNA探針，通過(guò)點(diǎn)雜交的辦法嘗試進(jìn)行了CYP3