細(xì)胞色素P450酶活性分析及抑制機(jī)理研究.pdf

1、肝臟細(xì)胞色素P450酶系(CYPs)負(fù)責(zé)人體90％以上的藥物代謝。因此,運(yùn)用體外代謝反應(yīng)體系(如肝微粒體)獲取肝藥酶動力學(xué)參數(shù)以預(yù)測或外推藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化行為,已成為當(dāng)前新藥研發(fā)中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。尤為關(guān)注的是CYP的機(jī)理性滅活(即自殺性抑制)或聯(lián)合用藥時(shí)多個共存組分對代謝酶清除能力的相互抑制所導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)日趨增大。如何準(zhǔn)確、快速地測定和表征藥酶催化活性的動力學(xué)參數(shù)和抑制機(jī)理,對候選化合物的類藥性篩選、體內(nèi)清除和藥物間相互作

2、用的評估十分重要。然而,目前大多數(shù)的CYP酶活分析方法都基于特征代謝產(chǎn)物的生成速率,并局限于單組分體系或簡單抑制作用的測試與評價(jià)。傳統(tǒng)方法不僅要求預(yù)先獲得代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品和較高的檢測靈敏度,也不適合多組分或復(fù)雜藥物相互作用體系的快速篩選。
　　 針對現(xiàn)有CYP酶活分析方法的局限性,本文對底物消除法測定酶動力學(xué)參數(shù)的實(shí)用性進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證；建立了快速篩選中藥復(fù)雜體系對人肝CYPs多酶體系抑制潛性的新方法；通過測定機(jī)理性抑制劑滅活參數(shù)推

3、測了滅活作用的抑制機(jī)理。
　　 論文主要工作如下:
　　 1.基于高效液相色譜技術(shù),以CYP的特異性底物非那西丁(CYP1A2)和右美沙芬(CYP2D6)為探針,比較底物消耗法和傳統(tǒng)產(chǎn)物生成法測定肝微粒體酶催化動力學(xué)參數(shù)值的差異,評價(jià)底物消除法測定微粒體酶藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的可行性；并進(jìn)一步探究了產(chǎn)生差異的因?yàn)?為合理使用底物消除法提供依據(jù)。
　　 2.基于流動注射-質(zhì)譜(FI-MS)直接檢測技術(shù),綜合運(yùn)用微孔板

4、溫孵、低溫樣品相分離、“6合1”進(jìn)樣、多探針同時(shí)定量分析手段,建立了一種適用于復(fù)雜中草藥對人體主要P450酶(5種同工酶6個探針反應(yīng))活性的抑制潛性進(jìn)行快速篩選與分類的新方法。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)僅用兩抑制劑濃度點(diǎn)測得的IC50值與通常七濃度梯度獲得的IC50值相近,兩點(diǎn)IC50測試的重現(xiàn)性良好。結(jié)合兩點(diǎn)IC50測試程序減少樣品數(shù)量,FI-MS/MS方法成功用于10種中藥材粗提液對5種P450酶抑制效應(yīng)的快速篩選與分類。
　　 3.基于高