皮膚細胞色素P450酶的表達調控及相關藥物代謝研究.pdf

1、皮膚是人體最大的器官，是機體和外界之間的天然屏障，可防止外界有害物質的入侵，也是藥物經皮吸收的給藥部位。皮膚表達有多種代謝酶，是肝外藥物代謝的主要器官之一。細胞色素P450酶系(cytochromeP450，CYP)是一組含亞鐵血紅素的酶，參與了許多內源性物質如類固醇、脂肪酸、膽酸、維生素D3、前列腺素、兒茶芬胺和許多進入體內的外源性物質如藥物、殺蟲劑、毒物、致癌物的代謝。涉及藥物代謝的CYP酶系主要有CYPl、CYP2和CYP3三個家

2、族。各類CYP酶在維持皮膚的正常生理功能和保持內環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用。研究皮膚中的CYP酶的表達特點有助于明確藥物的經皮吸收機理和藥物在皮膚的代謝過程，從而對提高藥物治療效果、開發(fā)經皮給藥新制劑、防止藥物和毒性物質對皮膚的侵害等，具有重要意義。 近年來，皮膚CYP酶的研究已成為皮膚藥理學的研究熱點。一方面皮膚是過敏和炎癥的頻發(fā)部位，發(fā)病機制復雜，角質形成細胞和成纖維細胞等參與了皮膚過敏、炎癥和免疫反應。探討病理因素在皮

3、膚CYP酶表達調節(jié)中的作用，為探索皮膚疾病的發(fā)病機制及臨床治療提供新靶點。另一方面，各種皮膚疾病的治療離不開藥物，而這些治療藥物又是多種CYP酶的底物，探討皮膚CYP相關的藥物代謝，有助于合理選擇治療藥物，減少藥物不良反應。 本研究首先建立了用于檢測皮膚多種CYP酶表達的免疫組化和RealtimePCR方法，考察了角質形成細胞和健康人皮膚組織CYP的表達特點。采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測銀屑病患者

4、皮損組織和經組胺刺激的HaCaT細胞CYPmRNA的表達改變，RealtimePCR法定量檢測CYP酶在HaCaT細胞中的表達調控，考察了細胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNγ對CYPmRNA表達的影響，研究了地塞米松和苯巴比妥對CYP的誘導作用。選擇右美沙芬為CYP2D6的探針藥物，采用LC/MS/MS方法檢測代謝產物去甲基右美沙芬的轉化量，研究其在大鼠皮膚勻漿中的代謝過程，并與肝勻漿代謝比較，來考察大鼠皮膚CYP2D6酶活性

5、和特比萘芬對CYP2D6的抑制作用。 第一部分免疫組化法檢測CYP在HaCaT細胞和健康人皮膚組織中的表達 采用免疫組化方法檢測了涉及藥物代謝的CYP1，2，3系列的5種CYP酶(CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9/19，CYP2D6，CYP3A4)在HaCaT細胞和健康人皮膚組織中的表達，結果表明： 1.健康人皮膚組織均可見5種CYP酶的棕黃色陽性表達，但表達強度存在差異，以CYP2C9/19，CYP2D

6、6和CYP3A4表達較強，CYP1A1次之，CYP1A2較弱。表達部位主要集中在表皮，以靠近皮膚外側的角質層更為明顯，皮脂腺、小汗腺和毛囊等皮膚附屬器及淋巴細胞、單核細胞等也有多種CYP酶表達。 2.HaCaT細胞和肝L02細胞均可見棕黃色陽性表達，L02細胞較HaCaT細胞表達更顯著。HaCaT細胞各種CYP酶的表達強度存在差異，以CYP1A1最強，其它均較弱；L02細胞各種CYP酶的表達強度差異不明顯。 第二部分Re

7、altimePCR法定量檢測CYPmRNA在HaCaT細胞和健康人皮膚組織中的表達 建立了同一體系下定量檢測CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYPC19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4八個CYP基因mRNA表達的RealtimePCR方法，并應用于健康人皮膚組織和HaCaT細胞的CYPmRNA檢測，結果表明： 1.CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYP2C19，C

8、YP2E1，CYP2D6和CYP3A4均可在健康人皮膚組織中檢測到，以CYP1A1，CYP1B1，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6表達水平較高，CYP1A2和CYP3A4表達水平較低。 2.包皮組織檢測結果顯示上述CYPmRNA表達具有較大的個體差異，其中CYP1A1個體差異最大，最低和最高表達量之間相差115.36倍。包皮組織與其它部位相應CYPmRNA表達相比，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1和CYP3A

9、4存在顯著性差異(P＜0.05)，CYP1A1和CYP2D6無顯著性差異(P＞0.05)；頭頸部皮膚組織與四肢軀體部位相比，僅CYP1A1mRNA表達存在顯著性差異(P＜0.05)，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4mRNA均無顯著性差異(P＞0.05)。 3.HaCaT細胞CYPmRNA表達水平總體與健康人皮膚組織一致，CYP1A2和CYP3A4表達較皮膚組織低。 第三

10、部分銀屑病患者皮損組織CYP的芯片檢測 采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測銀屑病患者皮損組織CYP酶mRNA表達情況(共23種)，并與健康皮膚組織比較，CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP3A5mRNA上調22.99％～32.76％;CYP24A1，CYP26B1，CYP2A6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1下調21.77％～45.08％。結果表明，CYP酶在銀屑病患

11、者皮損組織表達發(fā)生了改變，這種改變可能與銀屑病的發(fā)病機制及局部皮損組織的免疫環(huán)境改變有關。與健康人基因表達相比，NOS上調了2.67倍，使NO水平顯著高于正常，NO可能參與了CYP的表達調控。 第四部分組胺刺激HaCaT細胞后CYP的芯片檢測 以組胺刺激HaCaT細胞，在體外模擬皮膚炎癥狀態(tài)，采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測細胞CYPmRNA表達情況，通過與未處理對照細胞及H1受體拮抗劑西替利

12、嗪干預進行比較，探討了組胺在CYP酶表達調控中的作用，為探索過敏炎癥發(fā)病機制及臨床治療提供新靶點。結果表明組胺僅上調CYP4B1表達(22.60％)，并可被西替利嗪逆轉；組胺對CYP11A1，CYP11B2，CYP1A1，CYP1B1，CYP20A1，CYP26B1，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A5，CYP4A11，CYP4F3下調20.91％～52.30％;鹽酸西替利嗪是新型H1受體拮抗劑，臨床廣泛

13、用于治療各種過敏性疾病。西替利嗪對組胺引起的CYP改變，有不同程度的恢復作用，說明H1受體參與了對CYP的調節(jié)，但組胺引起的CYP下調不能完全被西替利嗪所逆轉，說明組胺對CYPmRNA表達的影響不完全由H1受體介導，可能還存在著其它的調節(jié)機制。 第五部分CYP酶在人表皮角質形成細胞中的表達調控 采用RealtimePCR法定量檢測CYP酶在HaCaT細胞中的表達調控，考察了細胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNY對

14、CYPmRNA表達的影響，研究了地塞米松和苯巴比妥對CYP的誘導作用。結果表明，TNFα，IL-6，IFNY對CYP2D6和CYP2E1的表達無明顯影響(P＞0.05)。20和100ng/ml濃度的IL-2校正CT值為11.86±0.53和11.62±0.32，與對照細胞校正CT值為10.53±0.14相比均有顯著性差異(P＜0.05)。20和100ng/ml的IL-2可分別使CYP2D6mRNA的表達下降到對照細胞的2.51和2.13

15、倍。但IL一2對CYP1A1mRNA無明顯影響(P＞0.05)。與肝CYP研究結果一致，地塞米松可誘導HaCaT細胞CYP3A4mRNA的表達，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。2×10-6M，1×10-5M和5×10-5M濃度的地塞米松分別使CYP3A4mRNA的表達增加到11.16，10.63和18.63倍；5×10-4M的高濃度苯巴比妥可以誘導HaCaT細胞CYP2C9mRNA的表達，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.0

16、5)。 第六部分皮膚右美沙芬經CYP2D6代謝與特比萘芬的抑制作用 采用右美沙芬為探針藥物，將右美沙芬加入至皮膚勻漿中進行37C孵育，通過建立測定皮膚勻漿中右美沙芬代謝產物去甲基右美沙芬濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)。通過測定去甲基右美沙芬的生成量及速度，來研究皮膚CYP2D6酶的活性，結果表明肝勻漿和皮膚勻漿均有CYP2D6的功能表達，能夠將右美沙芬轉化為去甲基右美沙芬，但皮膚勻漿中轉化的量少。