重組人細(xì)胞色素P450酶催化氟西汀立體選擇性代謝研究.pdf

1、本課題首先采用實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒表達(dá)獲得了人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*11,*2)和CYP2D6*1重組酶;建立了基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜識(shí)別技術(shù)的氟西汀(Fluoxetine,Fix)及其代謝物諾氟西汀(Norfluoxetine,Nflx)的手性LC-MS/MS分析方法;考察了11個(gè)重組酶亞型催化氟西汀代謝的立體選擇性。
　　 1人重組酶在Sf9細(xì)胞中的表

2、達(dá)和活性鑒定
　　 目的通過(guò)桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*1,*2)和CYP2D6*1重組酶,并在蛋白表達(dá)水平和活性水平進(jìn)行鑒定。
　　 方法從實(shí)驗(yàn)室已保存的DH10Bac-pFastbac-CYP2C9(*1,*3,*13,*16),DH10Bac-pFastbac-CYP2D6*1,DH10Bac-pFastbac-C

3、YPOR,DH10Bac-pFastbac-CYPB5等菌中分別提取重組粘粒(Bacmid-CYP2C9*1,*3,*13,*16,Bacmid-CYP2D6*1,Bacmid-CYPOR,Bacmid-CYPB5),轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,產(chǎn)生重組桿狀病毒,擴(kuò)增得到的較高滴度的病毒。通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定其滴度后,利用靶病毒和OR,B5病毒共同感染Sf9細(xì)胞獲得野生型和突變體重組酶(CYP2C8和CYP2C19直接利用實(shí)驗(yàn)室已有靶病毒表達(dá)重組

4、酶)。采用Westernblot檢測(cè)重組酶在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。利用重組酶與各自經(jīng)典底物共孵育孵育,LC-MS法檢測(cè)代謝產(chǎn)物確定重組酶的活性。
　　 結(jié)果Westernblot檢測(cè)到55kD左右有清晰條帶出現(xiàn),與重組酶預(yù)期大小一致,表明目的蛋白在細(xì)胞中得到良好表達(dá)。與經(jīng)典底物共孵育實(shí)驗(yàn)表明重組酶活性良好。
　　 結(jié)論所述各種重組酶均在Sf9細(xì)胞得到成功表達(dá),代謝活性良好,可用于后續(xù)體外代謝實(shí)驗(yàn)。
　　 2立體選擇性

5、定量分析Fix和Nflx對(duì)映體方法的建立
　　 目的建立一個(gè)靈敏,快速,可高通量選擇性定量測(cè)定Fix及其去甲基化代謝產(chǎn)物Nflx的方法,用于生物樣本(體外孵育液)中Flx及代謝產(chǎn)物Nflx的檢測(cè),進(jìn)而考察重組酶催化氟西汀的體外代謝情況。
　　 方法利用質(zhì)譜高靈敏度和選擇性的特點(diǎn),結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù),開(kāi)發(fā)可同時(shí)選擇性定量分析Flx對(duì)映體及其代謝產(chǎn)物Nflx對(duì)映體的LC-MS/MS方法。
　　 結(jié)果方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果表明,此法對(duì)R-Flx在1～1000ng·mL-1,s-Flx-d5在1～1000ng·mL-1,R-Nflx在0.1～100ng·mL-1,S-Nflx-d5在0.1～100ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系皆良好(R^2＞0.999),R-Flx定量限1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=5.5％),S-Flx-d5定量限1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=6.1%),R-Nflx定量限0.1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=6

7、.5%),S-Nflx-d5定量限0.1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=7.6%),方法回收率在96.9%～109.2%,日內(nèi)、日間精密度RSD均＜10%。
　　 結(jié)論建立的LC-MS分析方法靈敏、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng),可用于Flx及其代謝產(chǎn)物Nflx對(duì)映體在孵育生物樣本中的定量檢測(cè)。
　　 3Flx體外孵育代謝研究
　　 目的測(cè)定所得各種人重組酶催化R,S和±Flx的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),考察CYP2C9催化下單映體R

8、和S-Flx之間的相互作用。
　　 方法在優(yōu)化過(guò)的孵育時(shí)間和酶濃度條件下,將一系列濃度的R,S和±Flx分別與重組酶共孵育,以代謝產(chǎn)物Nflx生成速率對(duì)底物濃度作圖,計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。選定R-Flx或S-Flx的濃度,選用一系列不同濃度其對(duì)映體,與CYP2C9重組酶共孵育,測(cè)定由R或S-Flx生成代謝產(chǎn)物的速率,以不加其對(duì)映體代謝產(chǎn)物生成量為100%,加入其對(duì)映體后生成量占不加的百分含量為縱坐標(biāo),所加對(duì)映體濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,

9、考察兩者之間的關(guān)系(計(jì)算IC50)。
　　 結(jié)果采用GraphadPrism軟件,以Michaelis-Menten模型或底物自身抑制模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析,獲得酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(詳細(xì)參見(jiàn)4.3部分)。CYP2C19*1,CYP2D6*1,CYP2C9*1,CYP2C8*1催化±Flx,R-Flx和S-Flx的代謝,Km如下:CYP2C19*1為7.3±1.1μM,3.8±0.4μM,13.5±1.3μM,CYP2D6*1為8.1±

10、1.0μM,4.2±0.7μM,7.5±1.2μM,CYP2C9*1為43.4±6.2μM,92.2±29.3μM,1660±359.4μM,CYP2C8*1為394.8±84.0μM,153.8±32.6μM,195±37.9μM;清除率Clint如下:CYP2C19*1為16.9,29.3,7.1mL·min-1·mg-1protein,CYP2D6*1為2.1,4.3,2.2mL·min-1·mg-1protein,CYP2C9*

11、1為2.86*10-2,1.89*10-2,7.4*10-4mL·min-1·mg-1protein,CYP2C8*1為3.52*10-2,3.95*10-2,3.44*10-2mL·min-1·mg-1protein;CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)和CYP2C19*1有底物自身抑制現(xiàn)象,Ksi分別為451.3±84.5μM,154.2±34.51μM,173.6±44.4μM,664.1±74.8μM,690.8±2

12、22.4μM;CYP2C9*1,*2,*3,*13,*16催化氟西汀代謝清除率R/S比值分別為25.5,13.4,15.4,6.6,15.6,CYP2C19*1為4.1,CYP2C19*2為3.1,CYP2D6為2.0,CYP2C8*1,*2,*3,*4分別為1.15,1.03,1.43,1.18。對(duì)各種重組酶突變體和野生型清除率的比較,突變體*3,*13和*16代謝氟西汀的清除率分別是野生型的33%、19%、57%(±Flx),46%

13、、25%、60%(R-Flx),76%、96%、98%(S-Flx);突變體CYP2C19*2是野生型的的27%(±Flx),25%(R-Flx)和34%(S-Flx);突變體CYP2C8分別是野生型的95%,212%,36%(±Flx),88%,338%,53%(R-Flx),98%,272%,51%(S-Flx)。CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)催化的對(duì)映體相互作用,R-Flx對(duì)S-Flx的IC50值分別為21.2μ

14、M,6.3μM,＞57.8μN(yùn),＞57.8μM,21.2μM,而S-Flx對(duì)R-Flx的IC50均大于57.0μM.
　　 結(jié)論重組酶CYP2C9,CYP2C19,CYP2C8,CYP2D6均能催化Flx的去甲基化代謝,CYP2C19和CYP2D6與氟西汀的親和力更強(qiáng),CYP2D6對(duì)S型氟西汀的親和力最強(qiáng)可能是其主要負(fù)責(zé)代謝S-Flx的原因之一,CYP2C19和CYP2D6的Clint遠(yuǎn)大于CYP2C9和CYP2C8,CYP2D

15、6含量很低,提示CYP2C19是催化氟西汀代謝最為重要的酶之一。重組酶CYP2C19*1和CYP2C9(所有亞型),存在底物自身抑制現(xiàn)象,提示長(zhǎng)期服藥時(shí),其他不被抑制的酶(如CYP2C8)參與氟西汀代謝的貢獻(xiàn)可能會(huì)增加。CYP2C9,CYP2C19和CYP2D6催化氟西汀的代謝呈現(xiàn)不同程度的立體選擇性差異,優(yōu)先代謝R-Flx,CYP2C8無(wú)明顯差異。CYP2C9差異最為明顯,可能是主要負(fù)責(zé)立體選擇性代謝的酶。CYP2C9和CYP2C19