人肝細(xì)胞色素b5對(duì)10種細(xì)胞色素P450亞型活性的影響.pdf

1、細(xì)胞色素b5(cytochrome b5，Cyt b5)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含血紅素的小分子蛋白，在膽汁酸去飽和、高鐵血紅素蛋白還原、類固醇生成及藥物代謝過程中通過向多種酶?jìng)鬟f電子發(fā)揮作用。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)在人體內(nèi)主要分布于肝臟，參與75％以上藥物代謝，主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等1

2、0種亞型。CYP活性的不同是臨床藥物個(gè)體差異的主要原因，最新的研究表明，Cyt b5能為CYP的催化反應(yīng)提供電子，增強(qiáng)CYP的催化反應(yīng)效率。Cyt b5在大樣本正常人肝中的表達(dá)水平目前尚無報(bào)道，Cyt b5在人肝微粒體（Human liver microsomes，HLM）水平對(duì)CYP活性個(gè)體差異的影響也很少有人報(bào)道。
　　用人肝微粒體作為研究對(duì)象更能準(zhǔn)確反應(yīng)自然狀態(tài)下Cyt b5對(duì)CYP代謝的影響，但是目前很少有關(guān)于人肝微粒體中

3、Cyt b5對(duì)CYP催化反應(yīng)影響的研究。故此我們首次系統(tǒng)研究了在正常人肝微粒體中Cyt b5含量對(duì)CYP催化反應(yīng)的影響。本研究采用大樣本正常人肝作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先用qPCR的方法測(cè)定107例人肝中Cyt b5 mRNA表達(dá)水平，然后用光譜法考察測(cè)定123例人肝微粒體中Cyt b5的蛋白含量，分析Cyt b5含量對(duì)10種CYP亞型酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，探討CYP活性個(gè)體差異的原因。
　　1方法：
　　1.1肝臟標(biāo)本的收集收集肝功

4、能正常的肝病患者肝標(biāo)本123例，標(biāo)本來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院及河南省腫瘤醫(yī)院。其中男性40例，女性83例，年齡在20-75歲，用藥史顯示近期未使用能夠顯著影響CYP酶活性的藥物。此次實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者已簽署知情同意書。
　　1.2人肝微粒體的制備使用差速離心法制備人肝微粒體。
　　1.3 Cyt b5蛋白含量測(cè)定使用光譜法測(cè)定Cyt b5蛋白含量。
　　1.4 Cyt b5 m

5、RNA含量的測(cè)定用Trizol法提取肝組織總RNA，然后將1μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，兩步法在7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用GAPDH作為內(nèi)參基因定量mRNA，用2-△CT計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。
　　1.5 CYP基因分型提取全基因組 DNA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在中國漢族人群中發(fā)生頻率大于1%的基因多態(tài)性位點(diǎn)共25個(gè)，由華大基因用SNP MassARRAY進(jìn)行分型檢測(cè)。
　　1.

6、6 CYP活性測(cè)定以非那西汀作為CYP1A2，香豆素作為CYP2A6，安非他酮作為CYP2B6，紫杉醇作為CYP2C8，甲苯磺丁脲作為CYP2C9，奧美拉唑作為CYP2C19，右美沙芬作為 CYP2D6，氯唑沙宗作為 CYP2E1，咪達(dá)唑侖作為CYP3A4/5的底物分別配制孵育體系，然后HPLC法檢測(cè)孵育體系的代謝產(chǎn)物濃度。
　　1.7統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，Prism5.0軟件作圖，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)

7、性檢驗(yàn)，其中大部分?jǐn)?shù)據(jù)屬于非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P<0.05。
　　2結(jié)果：
　　2.1 Cyt b5含量
　　2.1.1 Cyt b5 mRNA107例人肝標(biāo)本中Cyt b5 mRNA表達(dá)水平最小值0.61，最大值7.44，中位數(shù)1.59，差異倍數(shù)12倍。
　　2.1.2 Cyt b5蛋白123例人肝標(biāo)本中Cyt b5蛋白含量最小值為33.75 pmol/mg，最大值為641.2

8、7 pmol/mg，中位數(shù)270.01 pmol/mg，蛋白含量也有較大的個(gè)體差異性，差異倍數(shù)為19。
　　2.2人口學(xué)因素對(duì)Cyt b5 mRNA表達(dá)水平和蛋白含量的影響
　　2.2.1人口學(xué)因素對(duì)Cyt b5 mRNA表達(dá)水平的影響根據(jù)性別、年齡（以45歲為界）、吸煙和飲酒對(duì)Cyt b5mRNA進(jìn)行分組，分析這些原因?qū)yt b5 mRNA的影響，發(fā)現(xiàn)性別、年齡、吸煙和飲酒均對(duì)Cyt b5mRNA無顯著性影響。
　

9、　2.2.2人口學(xué)因素對(duì)Cyt b5蛋白含量的影響根據(jù)性別、年齡（以45歲為界）、吸煙和飲酒對(duì)Cyt b5蛋白含量進(jìn)行分組，分析這些原因?qū)yt b5蛋白含量的影響，結(jié)果顯示，男性中Cyt b5蛋白含量顯著高于女性（P=0.002），吸煙組中Cyt b5蛋白含量顯著高于不吸煙組（P=0.006），年齡和飲酒對(duì)Cyt b5蛋白含量沒有影響。
　　2.310種 CYP基因分型結(jié)果25個(gè) SNP位點(diǎn)等位基因的突變頻率從1.1%(CYP3

10、A4*18A)到69.4%(CYP3A5*3)，與文獻(xiàn)報(bào)道的中國人的頻率一致。
　　2.4 Cyt b5對(duì)10種CYP總體活性的影響
　　2.4.1 Cyt b5 mRNA表達(dá)水平對(duì)10種CYP總體活性的影響 Cyt b5 mRNA表達(dá)水平對(duì)5種CYP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax有顯著影響（P<0.05），它們分別是CYP2B6（r=0.619）、CYP2D6（r=0.269）和CYP3A4/5（r=0.439）。Cyt b5的m

11、RNA對(duì)3種CYP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km有顯著影響P<0.05），分別是CYP2C8（r=0.236）和CYP3A4/5（r=0.223）。Cyt b5的mRNA對(duì)2種CYP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Clint有顯著影響（P<0.05），分別是CYP2B6（r=0.452）和CYP2D6（r=0.438）。其中，CYP2B6和CYP2D6的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax、Clint同時(shí)受到Cyt b5 mRNA的影響，CYP3A4/5的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax、Km

12、同時(shí)受到Cyt b5 mRNA的影響。
　　2.4.2 Cyt b5蛋白含量對(duì)10種CYP總體活性的影響 Cyt b5的蛋白含量對(duì)7種CYP酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax有顯著影響（P<0.05），分別是CYP1A2（r=0.377）、CYP2B6（r=0.416）、CYP2C19（r=0.282）、CYP2D6（r=0.467）、CYP2E1（r=0.316）和CYP3A4/5（r=0.322）。Cyt b5的蛋白含量對(duì)8種CYP的酶動(dòng)

13、力學(xué)參數(shù)Clint有顯著影響（P<0.05），分別是CYP1A2（r=0.343）、CYP2B6（r=0.391）、CYP2C9（r=0.240）、CYP2C19（r=0.283）、CYP2D6（r=0.375）、CYP2E1（r=0.352）和CYP3A4/5（r=0.197）。Cyt b5的蛋白含量對(duì)10種CYP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km均沒有影響。
　　2.5 Cyt b5對(duì)10種不同基因型的CYP活性的影響
　　2.5.1

14、Cyt b5 mRNA表達(dá)水平對(duì)不同基因型的CYP活性的影響 Cyt b5 mRNA對(duì)CYP1A25347C>T、-3113A>G，CYP2A6*4，CYP2B6516G>T、785A>G，CYP2C8*1B、*1C，CYP2D6100C>T、1661G>C、2850C>T，CYP3A420070T>C、20230G>A及CYP3A5*3突變活性有顯著影響（P<0.05）。
　　2.5.2 Cyt b5蛋白含量對(duì)不同基因型的CYP

15、活性的影響 Cyt b5蛋白含量對(duì)CYP1A2-3860G>A、-163C>A、5347C>T、-3113A>G、2159G>A，CYP2A6*1B，CYP2B6516G>T、785A>G，CYP2C9*3，CYP2C19*2、*3，CYP2D6100C>T、1661G>C、2850C>T，CYP2E1-1293G>C、7632T>A、-333T>A、-352A>G,CYP3A420070T>C、20230G>A及CYP3A5*3突變活